Isolasjon, kultur og karakterisering av primære Schwann-celler, Keratinocytter og Fibroblaster fra Human Foreskin

Summary

Studien av sårheling forbundet med muskel- og skjelettskader krever ofte vurdering av in vitro interaksjoner mellom Schwann-celler (SCer), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokollen beskriver isolasjon, dyrking og karakterisering av disse primære cellene fra den menneskelige forhuden.

Abstract

Denne protokollen beskriver isolasjonsmetoder, fortykningsforhold og karakterisering av menneskelige primærceller med høyt utbytte og levedyktighet ved hjelp av rask enzymatisk dissosiasjon av huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra det nyfødte forhuden, som er tilgjengelig etter standard omsorgsprosedyrer. Den fjernede huden desinfiseres, og det subkutane fettet og muskelen fjernes ved hjelp av en skalpell. Metoden består av enzymatisk og mekanisk separasjon av epidermale og dermale lag, etterfulgt av ytterligere enzymatisk fordøyelse for å oppnå encellede suspensjoner fra hvert av disse hudlagene. Til slutt vokser enkeltceller i passende cellekulturmedier etter standard cellekulturprotokoller for å opprettholde vekst og levedyktighet over uker. Sammen tillater denne enkle protokollen isolasjon, culturing og karakterisering av alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud for in vitro-evaluering av hudnervemodeller. I tillegg kan disse cellene brukes sammen i samkulturer for å måle deres effekter på hverandre og deres respons på in vitro traumer i form av riper utført robotisert i kulturen forbundet med sårheling.

Introduction

Primærceller avledet fra levende vev og dyrket under in vitro-forhold ligner nært på den fysiologiske tilstanden¹, noe som gjør dem til en ideell modell for å undersøke fysiologiske og patofysiologiske prosesser. Huden inneholder flere celletyper, inkludert keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SCer), som kan isoleres og dyrkes for in vitro-eksperimenter . Metoder for å isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SCer, fra et enkelt stykke hud, har ikke blitt beskrevet. Målet med denne protokollen er todelt: 1) å etablere en pålitelig og reproduserbar metode for isolering og dyrking av dermale SCer og 2) å bruke en effektiv, robust metode for isolering av keratinocytter, fibroblaster og SCer fra et enkelt menneskelig forhud.

For tiden er det etablerte protokoller for å isolere hud keratinocytter ^2,3,4 og fibroblaster ^5,6. Disse studiene beskriver isolasjonen av enten keratinocytter, fibroblaster eller begge deler fra huden, men ingen protokoll tar for seg hvordan man etablerer kulturer av primære SCer fra menneskelig hud. Nyere studier tyder på at nevronale SCs modulerer keratinocytt og fibroblast cellulære prosesser og regulerer normale hudfysiologiske funksjoner⁷. SCs er dermed kritiske for huden homeostase og bidrar vesentlig til regulere fysiologi som påvirker oppførselen til nærliggende hudcelletyper tilstede⁸. Derfor er en protokoll som tillater isolering av hver av disse celletypene, ideell for in vitro-eksperimenter som involverer cellecellekommunikasjon eller kryssprat mellom celletyper.

Denne protokollen beskriver etableringen av individuelle cellekulturer av primærceller fra et enkelt stykke hud. Denne protokollen er spesielt nyttig når mengden vev som er tilgjengelig er begrenset. Videre tillater isolasjon av alle tre celletyper fra en enkelt donor robuste sammenligninger mellom celletyper eller samkultureksperimenter samtidig som genetikken reduseres under ønsket eksperiment.

Protocol

Oppkjøp og bruk av av-identifisert humant forhudsvev til forskningsformål ble gjennomgått og fikk bestemmelsen om “ikke menneskelig forskning” av Penn State College of Medicine Institutional Review Board (IRB #17574). MERK: Ved å følge protokollen nedenfor oppnås 2,4 x 106 keratinocytter, 4,4 x 106 fibroblaster og 1,1 x 106 SCer fra et enkelt forhud. Generelt kan disse primære cellene brukes til 3 passasjer, avhengig av de eksperimentelle forholdene….

Representative Results

Normal neonatal forhud ble brukt til isolering av primære epidermale keratinocytter og dermale SCer og fibroblaster. De isolerte primærcellene ble dyrket i respektive cellekulturmedier som inneholdt vekstfaktorer. Etter sådd av SCs og fibroblast i kulturflasker, festet de fleste cellene seg til bunnen av kolben innen 2 timer. Når det gjelder keratinocytter, ble de fleste keratinocytter festet med 24 timer. Isolerte epidermale primære keratinocytter nådde 85% samløp etter dag 7 og viste karakteristisk cellemorfolog…

Discussion

Denne protokollen beskriver en metode for å isolere tre forskjellige cellepopulasjoner fra en enkelt del av forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Det er noen få isolasjonsprotokoller tilgjengelig for å isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolasjon. Bortsett fra de viktigste strukturelle cellene i huden, keratinocytter og fibroblas…

Materials

0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone)	MilliporeSigma	SLGPR33RS
70 µM cell strainers	CELLTREAT	229483
100 µM cell strainers	CELLTREAT	229485
1 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD-309659
5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use)	BD Luer-Lok	BD309646
10 mL disposable syringes	BD Luer-Lok	BD305462
1% TritonX-100	Sigma	X100-1L	Prepared at the time of use
4% paraformaldehyde solution	ThermoFisher Scientific	J19943.K2	Ready to use and store at 4 °C
5% BSA	Sigma	A7906-100G	Prepared at the time of use
70% ethanol	Pharmco	111000200
Antibiotic	ScienCell Research	503
Chemometec Vial1-Cassette	Fisher Scientific	NC1420193
Collagenase	Gibco	17018-029
Coverslip	Fisherbrand	12544D 22*50-1.5
Dispase I	Sigma-Aldrich	D46693
DMEM basal medium	ScienCell Research	9221
Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS)	Corning	21-031-CV)
Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339651
Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	ThermoFisher Scientific	339653
1.5 mL micro-centrifuge tubes	Fisherbrand	02-681-5
Fetal bovine serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	10082147
Fibroblast complete medium	ScienCell Research	2331
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11032	Dilution (1:500)
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11008	Dilution (1:500)
Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer)	Lonza	CC-5022
Human foreskin			De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574).
KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements)	Lonza	00192151 and 00192152
Mouse alpha-smooth muscle actin antibody	ThermoFisher Scientific	14-9760-82	Dilution (1:200)
Mouse Cytokeratin14 antibody	Abcam	ab7800	Dilution (1:100)
Mouse S100 antibody	ThermoFisher Scientific	MA5-12969	Dilution (1:200)
Multi chambered (4 well glass slide)	Tab-Tek	154526
NucleoCounter -Via1-Cassette	Chemometec	941-0012
Poly-L-Lysisne (PLL)	ScienCell Research	32503
ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36935
Rabbit K10 antibody	Sigma-Aldrich	SAB4501656	Dilution (1:100)
Rabbit p75-NTR antibody	Millipore	AB1554	Dilution (1:500)
Rabbit vimentin	ProteinTech	10366-1-AP	Dilution (1:200)
Schwann cell culture medium	ScienCell Research	1701
Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5	ROTH	LH75.1	Sterilize with 70% alcohol before use
IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm)	Codman	54-6500	Sterilize with 70% alcohol before use
Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades)	Razor blade company	94-0120	Sterilize with 70% alcohol before use
T25 culture flask	Corning	353109
Trypsin neutralization buffer (TNS)	Lonza	CC-5002
Trypsin/EDTA	Lonza	CC-5012
Inverted microscope	ZEISS	Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope	For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells
Inverted microscope	ZEISS	Primovert	For visulaizing/observing cell attachment or detachment