Isolering, kultur och karakterisering av primära Schwann-celler, keratinocyter och fibroblaster från mänsklig förhud
Summary
Studien av sårläkning i samband med muskuloskeletal skada kräver ofta bedömning av in vitro-interaktioner mellan Schwann-celler (SC), keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll beskriver isolering, odling och karakterisering av dessa primära celler från den mänskliga förhuden.
Abstract
Detta protokoll beskriver isoleringsmetoder, odlingsförhållanden och karakterisering av humana primära celler med högt utbyte och livskraft med hjälp av snabb enzymatisk dissociation av huden. Primära keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler skördas alla från den mänskliga nyfödda förhuden, som är tillgänglig enligt standardvårdsprocedurer. Den borttagna huden desinficeras och det subkutana fettet och muskeln avlägsnas med en skalpell. Metoden består av enzymatisk och mekanisk separation av epidermala och dermala lager, följt av ytterligare enzymatisk matsmältning för att erhålla encellssuspensioner från vart och ett av dessa hudskikt. Slutligen odlas enstaka celler i lämpliga cellodlingsmedier enligt standardcellodlingsprotokoll för att upprätthålla tillväxt och livskraft under veckor. Tillsammans möjliggör detta enkla protokoll isolering, odling och karakterisering av alla tre celltyperna från en enda hudbit för in vitro-utvärdering av hudnervmodeller. Dessutom kan dessa celler användas tillsammans i samkulturer för att mäta deras effekter på varandra och deras svar på in vitro-trauma i form av repor som utförs robotiskt i kulturen i samband med sårläkning.
Introduction
Primära celler som härrör från levande vävnad och odlas under in vitro-förhållanden liknar det fysiologiska tillståndet1, vilket gör dem till en idealisk modell för att undersöka fysiologiska och patofysiologiska processer. Huden innehåller flera celltyper, inklusive keratinocyter, fibroblaster, sebocyter, melanocyter och Schwann-celler (SC), som kan isoleras och odlas för in vitro-experiment . Metoder för att isolera och odla keratinocyter, fibroblaster och SC, från en enda hudbit, har inte beskrivits. Målet med detta protokoll är tvåfaldigt: 1) att upprätta en tillförlitlig och reproducerbar metod för isolering och odling av dermala SC och 2) att använda en effektiv, robust metod för isolering av keratinocyter, fibroblaster och SC från en enda human förhud.
För närvarande finns det etablerade protokoll för att isolera hud keratinocyter 2,3,4 och fibroblaster 5,6. Dessa studier beskriver isoleringen av antingen keratinocyter, fibroblaster eller båda från huden, men inget protokoll behandlar hur man etablerar kulturer av primära SC från mänsklig hud. Nya studier tyder på att neuronala SC modulerar keratinocyt- och fibroblastcellulära processer och reglerar normala hudfysiologiska funktioner7. SCs är således kritiska för hudhomeostas och bidrar väsentligt till regleringsfysiologin som påverkar beteendet hos närliggande hudcelltyper närvarande8. Därför är ett protokoll som möjliggör isolering av var och en av dessa celltyper idealiskt för in vitro-experiment som involverar cell-cellkommunikation eller korsprat mellan celltyper.
Detta protokoll beskriver upprättandet av enskilda cellkulturer av primära celler från en enda hudbit. Detta protokoll är särskilt användbart när mängden tillgänglig vävnad är begränsad. Dessutom möjliggör isolering av alla tre celltyperna från en enda givare robusta jämförelser mellan celltyper eller samodlingsexperiment samtidigt som man mildrar genetikens inflytande under det önskade experimentet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att isolera tre distinkta cellpopulationer från en enda bit av förhuden, nämligen keratinocyter, fibroblaster och Schwann-celler. Det finns några isoleringsprotokoll tillgängliga för att isolera keratinocyter och fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortsett från de viktigaste strukturella cellerna i hud, keratinocyter och fibrob…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Dr. Fadia Kamal och Dr. Reyad Elbarbary för att vi fick använda labbinstrument och teknisk support. Detta arbete stöddes av bidrag från NIH (K08 AR060164-01A) och DOD (W81XWH-16-1-0725) till J. C. E. förutom institutionellt stöd från Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Riferimenti
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
