التصوير البؤري وفائق الدقة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي أثناء تكوين بويضات ذبابة الفاكهة
Summary
الغشاء السفلي ضروري لتشكل الأنسجة والأعضاء أثناء التطوير. لفهم أفضل للآليات التي تؤدي إلى وضع هذا الهيكل بشكل صحيح ، يصف البروتوكول المقدم طرقا لتصور وتوصيف الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات الغشاء السفلي في الخلايا الظهارية باستخدام المجهر البؤري وفائق الدقة.
Abstract
الغشاء السفلي (BM) – وهو ورقة متخصصة من المصفوفة خارج الخلية الموجودة في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية – أمر بالغ الأهمية لإنشاء وصيانة مورفولوجيا الأنسجة الظهارية ومورفوجينيا الأعضاء. علاوة على ذلك ، فإن BM ضروري لنمذجة الأنسجة ، حيث يعمل كمنصة إشارات ، ويوفر قوى خارجية لتشكيل الأنسجة والأعضاء. على الرغم من العديد من الأدوار الهامة التي يلعبها BM أثناء التطور الطبيعي والظروف المرضية ، فإن المسارات البيولوجية التي تتحكم في الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وكيف يؤدي الإفراز القاعدي إلى الترسيب المستقطب لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي ممتاز لدراسة الترسيب القاعدي لبروتينات غشاء BM ، لأنها تنتج وتفرز جميع المكونات الرئيسية ل BM. يسمح التصوير البؤري والفائق الدقة جنبا إلى جنب مع معالجة الصور في الأنسجة الثابتة بتحديد وتوصيف العوامل الخلوية المشاركة على وجه التحديد في الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM. تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا لتلطيخ وتصوير الحويصلات المحتوية على BM و BM المودعة باستخدام بروتينات موسومة داخليا في الظهارة الجريبية لمبيض ذبابة الفاكهة . يمكن تطبيق هذا البروتوكول لمعالجة كل من الأسئلة النوعية والكمية وتم تطويره لاستيعاب الفحص عالي الإنتاجية ، مما يسمح بالتحديد السريع والفعال للعوامل المشاركة في الاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز الحويصلات أثناء تطور الأنسجة الظهارية.
Introduction
الغشاء السفلي (BM) هو ورقة رقيقة من مصفوفة خارج الخلية ملتصقة بالخلايا (ECM) ذات طبقات ضرورية للبنية الظهارية والتشكل1. وهو يتألف من ~ 50 بروتينا ويوجد في كل مكان وراء الخلايا الظهارية والبطانية ، ويغلف خلايا العضلات الهيكلية والملساء والقلبية والخلايا الشحمية1،2،3. المكونات الرئيسية الثلاثة ل BM في الجانب القاعدي من الخلايا الظهارية هي الكولاجين الرابع والبيرليكان واللامينين. BM يكمن وراء الخلايا الظهارية وهو مسؤول عن العديد من الوظائف ، بما في ذلك فصل الأنسجة وحاجزها ، والنمو والدعم ، واستقطاب الخلايا2،3،4،5،6،7،8،9،10،11،12 . دورها كمنصة إشارات ينظم مورفولوجيا وتمايز الخلايا والأنسجة الظهارية أثناء التطور3،13،14. علاوة على ذلك ، فإن سوء تنظيم BM و / أو خرق سلامته هما السببان الرئيسيان للعديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك ورم خبيثورم 2،15،16. على الرغم من الوظائف الأساسية التي يؤديها BM أثناء تكوين الأنسجة والأعضاء ، فإن مكونات المسار (المسارات) البيولوجية المخصصة للاتجار المستقطب داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM معروفة بشكل غامض.
لدراسة الاتجار داخل الخلايا للحويصلات المحتوية على BM وإفراز بروتينات BM بواسطة الخلايا الظهارية ، فإن الظهارة الجريبية (FE) لمبيض ذبابة الفاكهة هي نظام نموذجي قوي (الشكل 1). يتكون مبيض ذبابة الفاكهة من 16-20 بنية طويلة تشبه الأنبوب ، تسمى المبيضات (الشكل 1A ، B) 17،18،19. يمكن اعتبار كل مبيض خط تجميع البيض ، مع التقدم العمري لغرف البيض (التي تؤدي كل منها إلى بويضة) التي تبدأ في الطرف الأمامي وتتحرك خلفيا ، حتى تخرج البويضة الناضجة عبر قناة البيض. يتم تغليف كل غرفة بويضة بواسطة FE ، وهي طبقة أحادية من خلايا الجريب الجسدية (FCs) ، التي تحيط بخلايا الخط الجرثومي المركزي (GCs). FE مستقطب للغاية مع قطبية قطبية قطبية قاعية مميزة حيث يواجه المجال القمي الخط الجرثومي ، ويتم إفراز بروتينات BM بشكل أساسي18,19. تفرز FCs بنشاط جميع المكونات الرئيسية ل BM ، بما في ذلك الكولاجين الرابع والبيرليكان و Laminins20,21. في الخلايا الظهارية مثل FCs ، يتم إنتاج مكونات BM وتتطلب مسار إفراز مستقطب متخصص لترسيبها خارج الخلايا. على سبيل المثال ، في حالة المكون الأكثر وفرة في BM ، الكولاجين IV (Coll IV) ، فإن التفاصيل المحيطة بالاتجار والإفراز المستقطبين داخل الخلايا غامضة على الرغم من أن إنتاجه وترسيبه هما محور العديد من الدراسات. يتم ترجمة Coll IV في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، والتي يتم فيها أيضا تجميع كل ليف – يتكون من ثلاثة ببتيدات متعددة (سلسلتان α1 وسلسلة α2 واحدة) – في حلزون ثلاثي22. يتطلب الطي السليم ل Coll IV ووظيفته مرافقات وإنزيمات ER ، بما في ذلك lysyl و prolyl-hydroxylases مثل Plod و PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. تنظم هذه الإنزيمات ما بعد الانتقالية فرز ER ل Coll IV ، حيث يؤدي فقدان كل منها إلى محاصرة Coll IV في ER القاعدي20,23,24,25,26. بعد ذلك ، يخرج Coll IV المركب حديثا من ER ل Golgi في الحويصلات المغلفة ب COPII. يساعد مستقبل الشحن Tango1 في تعبئة الكولاجين في حويصلات كبيرة مرتبطة ب Golgi يمكنها استيعاب بروتينات كبيرة متعددة الوسائط20,27. بمجرد تعبئة Coll IV في حويصلات خارجية داخل الخلايا ، يتم إفرازه بشكل أساسي من الخلايا الظهارية. لتوجيه ترسب BM إلى الجانب القاعدي ، تتطلب الخلايا الظهارية مجموعة أخرى من العوامل المخصصة خصيصا لإفراز BM المستقطب. باستخدام FE من مبيض ذبابة الفاكهة ، تم توصيف بعض مكونات هذه العملية الخلوية الجديدة ، بما في ذلك عوامل تبادل النيوكليوتيدات (GEFs) Crag و Stratum ، و GTPases Rab8 و Rab10 ، بالإضافة إلى مستويات phosphoinositide PI (4,5) P2 ، و Kinesin 1 و 3 البروتينات الحركية 20,28,29,30,31 . هذه المكونات حاسمة في ضمان التوزيع المستقطب لبروتينات BM.
لمراقبة التوطين داخل الخلايا لبروتينات BM في FE ، يمكن استخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا (مصائد البروتين) ، مثل Viking-GFP (Vkg-GFP أو α2 Coll IV-GFP) و Perlecan-GFP (Pcan-GFP)32,33. وقد ثبت أن خطوط فخ البروتين هذه تعكس بدقة التوزيع الداخلي لبروتينات BM وتسمح باكتشاف أكثر حساسية للاتجار الحويصلي28,30. تم تمييز المكونات المشاركة في الترسيب المستقطب ل BM في FE لأول مرة باستخدام خطوط مصيدة البروتين ل Vkg-GFP و Pcan-GFP 20,28,29,30. يمكن استخدام مصائد البروتين في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الطفرات وخطوط Gal4 34. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام مصائد البروتين مع أصباغ الفلورسنت و / أو تلطيخ المناعة الفلورية ، مما يسمح بتوصيف دقيق لتوطين بروتينات BM عند مقارنة النوع البري والظروف الطافرة35.
لتقييم توزيع وتوطين الحويصلات المحتوية على بروتين BM بدقة وكفاءة، يقدم الفحص المجهري للمسح بالليزر البؤري (CLSM) وتقنيات التصوير فائقة الدقة ميزة كبيرة لأساليب التصوير الأخرى. تجمع هذه الأساليب بين التصوير عالي الدقة وسهولة الاستخدام النسبية. CLSM هي تقنية الفحص المجهري التي تسمح بتحسين الدقة البصرية عن طريق مسح العينة بالليزر بطريقة المسح النقطي باستخدام الجلفانومترات. فتحة الثقب هي مكون أساسي في المجهر البؤري. من خلال حجب الإشارات خارج التركيز البؤري القادمة من أعلى أو أسفل المستوى البؤري، ينتج عن فتحة الثقب دقة فائقة للغاية في المحور z36. هذا يجعل من الممكن أيضا الحصول على سلسلة من الصور في المستوى z ، تسمى z-stack ، المقابلة لسلسلة من الأقسام البصرية. تقوم مكدسات z لاحقا بإنشاء صورة ثلاثية الأبعاد للعينة ، عبر إعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد ، بمساعدة برنامج التصوير. تسمح المجاهر التقليدية الفائقة التألق (واسعة المجال) ، على عكس المجاهر البؤرية ، للضوء خارج التركيز البؤري بالمساهمة في جودة الصورة ، مما يقلل من دقة الصورة والتباين36,37. وهذا يجعل المجهر الفائق التألق مرشحا أقل جاذبية عند دراسة توطين البروتين أو التوطين المشترك.
على الرغم من أن CLSM هو نهج مناسب لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك التصوير وتوصيف الاتجار داخل الخلايا من بروتينات BM ، إلا أنه لا يزال يمثل مشكلة عند تصوير عينات أقل من حد حيود آبي للضوء (200-250 نانومتر). عند تصوير مثل هذه العينات ، يمكن أن يؤدي الفحص المجهري البؤري ، خاصة عند استخدام هدف نفطي ، إلى دقة عالية. ومع ذلك ، فإن تقنيات الدقة الفائقة تتجاوز حد الفحص المجهري البؤري. هناك العديد من الأساليب لتحقيق الفحص المجهري فائق الدقة ، لكل منها حدود دقة محددة ، وكل منها مناسب للتحليلات المختلفة. وتشمل هذه النهج مجهر التوطين المنشط ضوئيا (PALM) أو المجهر البصري العشوائي لإعادة البناء (STORM) ، والفحص المجهري لاستنفاد الانبعاثات المحفزة (STED) ، ومجهر الإضاءة الهيكلية (SIM) ، ومجهر Airyscan (فائق الدقة)38،39،40،41،42،43،44،45،46 . على الرغم من أن Airyscan لديه دقة أكثر خشونة من PALM / STORM ، STED ، و SIM ، إلا أنه لا يزال بإمكانه تحقيق دقة تصل إلى ~ 120 نانومتر (حوالي ضعف دقة CLSM). علاوة على ذلك ، فقد ثبت أن نهج الفحص المجهري فائق الدقة هذا يتمتع بميزة على بطاقة SIM وغيرها من التقنيات فائقة الدقة عند تصوير عينات سميكة وعينات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة47,48.
Airyscan هي تقنية مجهرية بؤرية فائقة الدقة جديدة نسبيا46. على عكس CLSMs التقليدية ، التي تستخدم كاشفات الثقب والنقطة الواحدة لرفض الضوء خارج التركيز البؤري ، يستخدم هذا النهج فائق الدقة كاشف منطقة أنبوب المضاعف الضوئي لأنبوب الزرنيخيد الغاليوم (GaAsP) المكون من 32 قناة والذي يجمع كل الضوء في كل موضع مسحضوئي 45. يعمل كل جهاز من أجهزة الكشف ال 32 كثقب صغير ، مما يقلل من حجم الثقب من وحدة 1.0 Airy Unit التقليدية (A.U.) إلى 0.2 A.U. المحسنة ، مما يتيح دقة أعلى ونسبة إشارة إلى ضوضاء ، مع الحفاظ على كفاءة قطر 1.25 A.U.45. علاوة على ذلك ، فإن فك الالتفاف الخطي المستخدم من قبل Airyscan يؤدي إلى زيادة تصل إلى 2x في الدقة45. مع أخذ ذلك في الاعتبار ، فإن CLSM ، وتحديدا الفحص المجهري فائق الدقة ، مناسب تماما لدراسة بروتينات BM والبروتينات التي تنظم الترسيب القاعدي لبروتينات BM ، حيث يمكنها إنتاج صور عالية الدقة للغاية لدراسات التوطين والتوطين المشترك ، وبالتالي توفير رؤى جديدة في الأحداث المكانية والزمانية والجزيئية التي تتحكم في هذه العمليات.
هناك نهج بديل للفحص المجهري البؤري الذي يمكن استخدامه لإجراء تجارب التوطين وهو إزالة التفاف الصورة. نظرا لأن الفحص المجهري واسع المجال يسمح للضوء خارج نطاق التركيز البؤري بالوصول إلى أجهزة الكشف ، يمكن تطبيق خوارزميات إزالة الالتفاف الرياضية والحسابية لإزالة أو إعادة تعيين الضوء خارج التركيز البؤري من الصور التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري واسع المجال ، وبالتالي تحسين دقة وتباين الصورة49. يمكن أيضا تطبيق خوارزميات فك الالتفاف على الصور متحدة البؤرة لزيادة الدقة والتباين ، مما ينتج صورا نهائية مماثلة تقريبا لتلك الموجودة في المجهر فائق الدقة50. تستفيد Airyscan من إزالة الالتفاف القائمة على مرشح Weiner إلى جانب إعادة تعيين بكسل Sheppard ، مما يؤدي إلى دقة مكانية محسنة للغاية ونسبة إشارة إلى ضوضاء. بالمقارنة مع المجهر البؤري ، لوحظت زيادة قدرها 2x في الدقة في جميع الأبعاد المكانية الثلاثة (120 نانومتر في x و y ، و 350 نانومتر في z) عند استخدام تقنية الفحص المجهري فائقة الدقة45,51.
توفر هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة ومحسنة لتلطيخ واكتساب وتصور الاتجار داخل الخلايا وترسب بروتينات BM باستخدام FE لمبيض ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي إلى جانب الفحص المجهري البؤري وفائق الدقة. خطوط ذبابة الفاكهة التي تعبر عن بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، على سبيل المثال ، Vkg-GFP و Pcan-GFP ، هي أدوات فعالة ودقيقة لتصور الاتجار ببروتين BM وإفرازه. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدامها بسهولة في خلفيات جينية مختلفة ، بما في ذلك الخطوط المتحورة و Gal4 / UAS 34. على الرغم من التوصية باستخدام بروتينات الغشاء السفلي الموسومة داخليا ، إلا أن استخدام الأجسام المضادة ضد بروتينات BM محددة متوافق أيضا مع البروتوكولات الموصوفة. هذه البروتوكولات مفيدة بشكل خاص للعلماء المهتمين بدراسة الاتجار داخل الخلايا وإفراز بروتينات BM في الأنسجة الظهارية السليمة باستخدام التصوير البؤري وفائق الدقة. علاوة على ذلك ، فإن القدرة على الجمع بين تحليل الأنسجة الظهارية والأدوات الواسعة لعلم الوراثة ذبابة الفاكهة تجعل هذا النهج قويا بشكل خاص. وأخيرا، يمكن تكييف هذه البروتوكولات بسهولة لدراسة الاتجار بالحويصلات وفرز البروتينات الأخرى ذات الأهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM أمر بالغ الأهمية للتكوين الجنيني والأعضاء ، والوظائف الفسيولوجية للبالغين. علاوة على ذلك ، يعمل BM كمنصة إشارات لإنشاء وصيانة القطبية الظهارية ويوفر الأنسجة مع الدعم2. ومع ذلك ، فإن الآليات التي تنظم الموضع السليم لبروتينات BM غير مفهومة بشكل جيد. يتطلب الفهم الأفضل للمسارات …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفون ممتنون لجولي ميركل على تعليقاتها المفيدة على المخطوطة. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة R15GM137236 إلى O.D. تم الحصول على الصور البؤرية وفائقة الدقة باستخدام Zeiss LSM 900 مع Airyscan 2 ، والتي تم شراؤها باستخدام منحة التصوير بالرنين المغناطيسي NSF 2018748.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
Riferimenti
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
- Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
- Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
- Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
- Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
- Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
- Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
- Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
- Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
- Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
- Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
- Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
- Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
- Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
- Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
- Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Biologia dello sviluppo. 227 (2), 690-705 (2000).
- Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
- Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
- Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
- Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
- Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
- Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetica. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetica. 201 (3), 815-842 (2015).
- Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetica. 211 (1), 15-34 (2019).
- Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
- Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
- Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
- Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
- Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
- Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
- He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
- Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
- Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetica. 208 (1), 1-18 (2018).
