La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.
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Articolo metodologico
Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila
In questo articolo
Sommario
Abstract
La membrana basale (BM) - un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali - è fondamentale per l'istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L'imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l'elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l'identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l'imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l'identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.
Introduzione
La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi1. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti 1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cu....
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Protocollo
1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche
- Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L'aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in quanto ciò può influire negativamente sullo sviluppo delle ovaie.
NOTA: Descrizione di Maschi e femmine di Drosophila e consigli utili e consig....
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Risultati
I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell'ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere o.......
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Discussione
Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d'organo e per le funzioni fisiologiche dell'adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l'istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto2. Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un'a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori sono grati a Julie Merkle per i suoi utili commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R15GM137236 a O.D. Le immagini confocali e super-risoluzioni sono state acquisite utilizzando uno Zeiss LSM 900 con Airyscan 2, acquistato con 2018748 di sovvenzione NSF MRI.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 546 falloidina | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 di 66µ M) |
| Alexa Fluor 647 falloidina | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 di 66µ M)) |
| Anticorpo Anti-GM130 | abcam | ab30637 | per la colorazione del Golgi (colocalizzazione); uso come concentrazione di 7µ g/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mezzo di montaggio |
| Lievito per panettieri (lievito secco attivo) | Genesee Scientific | 62-103 | Per ingrassare le overies per la dissezione |
| Albumina sierica bovina (soluzione al 30%) | Sigma-Aldrich | A7284 | Per la soluzione bloccante |
| Pozzetti di depressione | Microscopia elettronica | 7156101 | Per la dissezione (al suo posto può essere utilizzato un vetrino di concavità) |
| Ago da dissezione | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi contro Crag |
| Azioni di mosca: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Azioni di mosche: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Guidare l'espressione dell'RNAi della falesia nelle | ||
| pinze FE (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | Per la dissezione |
| Vetrino per concavità Microscopia | elettronica Scienze | 7187804 | Per la dissezione (al loro posto possono essere utilizzati pozzetti di depressione) |
| Capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Anticorpo secondario (anticorpo GM130) (5 &; g/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Tergicristalli per attività delicate |
| Stereomicroscopio fluorescente Leica M165 FC | Leica | Per l'imaging delle ovaie | |
| Vetrini per microscopio | Corning | 294875X25 | Vetrini per microscopio |
| Piattaforma di nutazione a bilanciere | Corning Life Sciences | 6720 | Per la fissazione e la colorazione delle ovaie |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldeide 20% Soluzione | Microscopia elettronica Scienze | Fisher Scientifico: 15713 | Per PFA 4% |
| Compresse Saline Tamponate con Fosfato | Fisher | scientific BP2944100 | Per soluzione |
| PBS ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Montaggio Quadrato Medio |
| Copertura in vetro | Corning | 285022 | Vetro di copertura per vetrini per microscopio |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | Per PBST |
| Zeiss LSM 900 con Airyscan 2 | Microscopio confocale e super-risoluzione | Zeiss | |
| Stereomicroscopio Stemi 305 Microscopio | dissezione | Zeiss Zeiss | |
| Zen Software versione 3.3 (Blue Edition) | Acquisizione ed elaborazione delle immagini | Zeiss |
Riferimenti
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., ....
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Ristampe e permessi
