ड्रोसोफिला ओजेनेसिस के दौरान ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और बेसमेंट मेम्ब्रेन प्रोटीन के स्राव के कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग
Summary
विकास के दौरान ऊतक और अंग आकृतिजनन के लिए तहखाने की झिल्ली आवश्यक है। इस संरचना के उचित प्लेसमेंट के लिए अग्रणी तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए, प्रस्तुत प्रोटोकॉल कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उपकला कोशिकाओं में तहखाने झिल्ली प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव की कल्पना और लक्षण वर्णन करने के तरीकों का वर्णन करता है।
Abstract
तहखाने झिल्ली (बीएम) – उपकला कोशिकाओं के बेसल पक्ष में मौजूद बाह्य मैट्रिक्स की एक विशेष शीट – उपकला ऊतक आकृति विज्ञान और अंग आकृति जनन की स्थापना और रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम ऊतक मॉडलिंग के लिए आवश्यक है, एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में सेवा करता है, और ऊतकों और अंगों को आकार देने के लिए बाहरी बल प्रदान करता है। सामान्य विकास और रोग स्थितियों के दौरान बीएम द्वारा निभाई जाने वाली कई महत्वपूर्ण भूमिकाओं के बावजूद, बीएम युक्त पुटिकाओं के इंट्रासेल्युलर तस्करी को नियंत्रित करने वाले जैविक मार्ग और बेसल स्राव बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत जमाव की ओर कैसे जाता है, खराब समझा जाता है। ड्रोसोफिला अंडाशय का कूपिक उपकला बीएम झिल्ली प्रोटीन के बेसल जमाव का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल प्रणाली है, क्योंकि यह बीएम के सभी प्रमुख घटकों का उत्पादन और स्राव करता है निश्चित ऊतकों में छवि प्रसंस्करण के साथ संयुक्त कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग विशेष रूप से बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और जमाव में शामिल सेलुलर कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। यह लेख धुंधला और इमेजिंग बीएम युक्त पुटिकाओं के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है और ड्रोसोफिला अंडाशय के कूपिक उपकला में अंतर्जात टैग किए गए प्रोटीन का उपयोग करके बीएम जमा करता है। इस प्रोटोकॉल को गुणात्मक और मात्रात्मक दोनों प्रश्नों को संबोधित करने के लिए लागू किया जा सकता है और इसे उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग को समायोजित करने के लिए विकसित किया गया था, जिससे ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और उपकला ऊतक विकास के दौरान पुटिकाओं के स्राव में शामिल कारकों की तेजी से और कुशल पहचान की अनुमति मिलती है।
Introduction
तहखाने झिल्ली (बीएम) स्तरित सेल-अनुयायी बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) की एक पतली शीट है जो उपकला संरचना और मॉर्फोजेनेसिस1 के लिए महत्वपूर्ण है। इसमें ~ 50 प्रोटीन शामिल हैं और उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं को सर्वव्यापी रूप से अंतर्निहित पाया जाता है, और कंकाल, चिकनी और हृदय की मांसपेशियों की कोशिकाओं और एडिपोसाइट्स 1,2,3 को शामिल करता है। उपकला कोशिकाओं के बेसल पक्ष पर बीएम के तीन मुख्य घटक कोलेजन चतुर्थ, पेर्लेकन और लैमिनिन हैं। बीएम उपकला कोशिकाओं को रेखांकित करता है और ऊतक पृथक्करण और बाधा, विकास और समर्थन, और सेल ध्रुवीकरण 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 सहित कई कार्यों के लिए जिम्मेदार है . सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में इसकी भूमिका 3,13,14 के विकास के दौरान उपकला कोशिकाओं और ऊतकों की आकृति विज्ञान और भेदभाव को नियंत्रित करती है। इसके अलावा, बीएम का गलत विनियमन और / या इसकी अखंडता में उल्लंघन ट्यूमर मेटास्टेसिस 2,15,16 सहित कई रोग स्थितियों के प्राथमिक कारण हैं। ऊतक और अंग मॉर्फोजेनेसिस के दौरान बीएम द्वारा किए गए आवश्यक कार्यों के बावजूद, ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और बीएम प्रोटीन के स्राव के लिए समर्पित जैविक मार्ग (ओं) के घटक अस्पष्ट रूप से ज्ञात हैं।
बीएम युक्त पुटिकाओं के इंट्रासेल्युलर तस्करी और उपकला कोशिकाओं द्वारा बीएम प्रोटीन के स्राव का अध्ययन करने के लिए, ड्रोसोफिला अंडाशय का कूपिक उपकला (एफई) एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली (चित्रा 1) है। एक ड्रोसोफिला अंडाशय में 16-20 लंबी, ट्यूब जैसी संरचनाएं होती हैं, जिन्हें अंडाशय (चित्रा 1 ए, बी) 17,18,19 कहा जाता है। प्रत्येक अंडाशय को अंडे की असेंबली लाइन के रूप में सोचा जा सकता है, अंडे के कक्षों की उम्र की प्रगति के साथ (जो प्रत्येक एक अंडे को जन्म देता है) जो पूर्वकाल के अंत में शुरू होता है और पीछे की ओर बढ़ता है, जब तक कि परिपक्व अंडा डिंबवाहिनी के माध्यम से बाहर नहीं निकलता। प्रत्येक अंडे के कक्ष को एफई द्वारा समझाया जाता है, जो दैहिक कूप कोशिकाओं (एफसी) का एक मोनोलेयर है, जो केंद्रीय जर्मलाइन कोशिकाओं (जीसी) को घेरता है। एफई को एक अलग एपिकल-बेसल ध्रुवीयता के साथ अत्यधिक ध्रुवीकृत किया जाता है जहां एपिकल डोमेन जर्मलाइन का सामना करता है, और बीएम प्रोटीन बेसली18,19 स्रावित होते हैं। एफसी सक्रिय रूप से बीएम के सभी प्रमुख घटकों का स्राव करते हैं, जिसमें कोलेजन चतुर्थ, पेर्लेकन और लैमिनिन20,21 शामिल हैं। एफसी जैसे उपकला कोशिकाओं में, बीएम घटकों का उत्पादन किया जाता है और बाह्य रूप से उनके जमाव के लिए एक विशेष ध्रुवीकृत स्राव मार्ग की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बीएम, कोलेजन चतुर्थ (कॉल चतुर्थ) के सबसे प्रचुर मात्रा में घटक के मामले में, इसके ध्रुवीकृत इंट्रासेल्युलर तस्करी और स्राव के आसपास के विवरण इसके उत्पादन और जमाव के बावजूद अस्पष्ट हैं जो कई अध्ययनों का ध्यान केंद्रित करते हैं। कोल चतुर्थ का अनुवाद एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में किया गया है, जहां प्रत्येक फाइब्रिल – तीन पॉलीपेप्टाइड्स (दो α1 श्रृंखला और एक α2 श्रृंखला) से बना है – एक ट्रिपल हेलिक्स22 में इकट्ठा किया जाता है। उचित कोल चतुर्थ तह और फ़ंक्शन के लिए ईआर चैपरोन और एंजाइमों की आवश्यकता होती है, जिसमें लाइसिल और प्रोलिल-हाइड्रॉक्सिलेज जैसे प्लोड और पीएच 4αईएफबी 20,22,23,24,25,26 शामिल हैं। ये पोस्टट्रांसलेशनल एंजाइम कोल चतुर्थ के ईआर सॉर्टिंग को विनियमित करते हैं, क्योंकि प्रत्येक के नुकसान से कोल चतुर्थ बेसल ईआर 20,23,24,25,26 में फंस जाता है। फिर, नव संश्लेषित कोल चतुर्थ सीओपीआईआई-लेपित पुटिकाओं में गोल्गी के लिए ईआर से बाहर निकलता है। कार्गो रिसेप्टर टैंगो 1 कोलेजन को बड़े गोल्गी-बाध्य पुटिकाओं में पैकेजिंग में सहायता करता है जो बड़े मल्टीमेरिक प्रोटीन20,27 को समायोजित कर सकता है। एक बार कोल चतुर्थ को इंट्रासेल्युलर एक्सोसाइटिक पुटिकाओं में पैक किया जाता है, तो यह विशेष रूप से उपकला कोशिकाओं से बेसली स्रावित होता है। बेसल पक्ष में बीएम जमाव को निर्देशित करने के लिए, उपकला कोशिकाओं को विशेष रूप से ध्रुवीकृत बीएम स्राव के लिए समर्पित कारकों के एक और सेट की आवश्यकता होती है। ड्रोसोफिला अंडाशय के एफई का उपयोग करते हुए, इस उपन्यास सेलुलर प्रक्रिया के कुछ घटकों की विशेषता है, जिसमें न्यूक्लियोटाइड एक्सचेंज फैक्टर (जीईएफ) क्रैग और स्ट्रेटम, जीटीपीस रब 8 और रब 10, साथ ही फॉस्फोइनोसाइटाइड पीआई (4,5) पी 2, और किनेसिन 1 और 3 मोटर प्रोटीन 20,28,29,30,31 के स्तर शामिल हैं। . बीएम प्रोटीन के ध्रुवीकृत वितरण को सुनिश्चित करने में ये घटक महत्वपूर्ण हैं।
एफई में बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर स्थानीयकरण की निगरानी के लिए, अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन (प्रोटीन जाल), जैसे वाइकिंग-जीएफपी (वीकेजी-जीएफपी या α2 कोल चतुर्थ-जीएफपी) और पेर्लेकन-जीएफपी (पीसीएन-जीएफपी) का उपयोग32,33 किया जा सकता है। इन प्रोटीन ट्रैप लाइनों को बीएम प्रोटीन के अंतर्जात वितरण को सटीक रूप से प्रतिबिंबित करने और पुटिका तस्करी28,30 के अधिक संवेदनशील पता लगाने की अनुमति देने के लिए दिखाया गया है। एफई में बीएम के ध्रुवीकृत जमाव में शामिल घटकों को पहले वीकेजी-जीएफपी और पीसीएएन-जीएफपी20,28,29,30 के लिए प्रोटीन ट्रैप लाइनों का उपयोग करके विशेषता दी गई थी। प्रोटीन जाल का उपयोग विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में किया जा सकता है, जिसमें म्यूटेंट और गैल 4 लाइनें34 शामिल हैं। इसके अलावा, प्रोटीन जाल का उपयोग फ्लोरोसेंट रंगों और / या प्रतिदीप्ति इम्यूनोस्टेनिंग के साथ संयोजन में किया जा सकता है, जिससे जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती स्थितियों की तुलना करते समय बीएम प्रोटीन के स्थानीयकरण के सटीक लक्षण वर्णन की अनुमति मिलती है।
बीएम प्रोटीन युक्त पुटिकाओं के वितरण और स्थानीयकरण का सटीक और कुशलतापूर्वक आकलन करने के लिए, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (सीएलएसएम) और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग तकनीक अन्य इमेजिंग दृष्टिकोणों के लिए एक महत्वपूर्ण लाभ प्रस्तुत करती है। ये दृष्टिकोण उपयोग की सापेक्ष आसानी के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग को जोड़ते हैं। सीएलएसएम एक माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो गैल्वेनोमीटर का उपयोग करके रेखापुंज स्कैन तरीके से लेजर के साथ नमूने को स्कैन करके एक बेहतर ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की अनुमति देती है। पिनहोल एपर्चर एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का एक मुख्य घटक है। फोकल प्लेन के ऊपर या नीचे से आने वाले आउट-ऑफ-फोकस सिग्नल को अवरुद्ध करके, पिनहोल एपर्चर के परिणामस्वरूप जेड-अक्ष 36 में अत्यधिक बेहतर रिज़ॉल्यूशनहोता है। यह जेड-प्लेन में छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त करना भी संभव बनाता है, जिसे जेड-स्टैक कहा जाता है, जो ऑप्टिकल वर्गों की एक श्रृंखला के अनुरूप है। जेड-स्टैक बाद में इमेजिंग सॉफ्टवेयर की सहायता से 3 डी पुनर्निर्माण के माध्यम से नमूने की 3 डी छवि बनाते हैं। कंफोकल माइक्रोस्कोप के विपरीत पारंपरिक एपिफ्लोरेसेंस (वाइडफील्ड) माइक्रोस्कोप, आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को छवि गुणवत्ता में योगदान करने, छवि रिज़ॉल्यूशन को कम करने और36,37 के विपरीत करने की अनुमति देते हैं। यह प्रोटीन स्थानीयकरण या कोलोकलाइजेशन का अध्ययन करते समय एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को कम आकर्षक उम्मीदवार बनाता है।
यद्यपि सीएलएसएम विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण है, जिसमें इमेजिंग और बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग के लक्षण वर्णन शामिल हैं, फिर भी यह एक मुद्दा प्रस्तुत करता है जब इमेजिंग नमूने प्रकाश की अब्बे की विवर्तन सीमा (200-250 एनएम) से नीचे होते हैं। ऐसे नमूनों की इमेजिंग करते समय, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी, खासकर जब एक तेल उद्देश्य का उपयोग करते हैं, तो उच्च रिज़ॉल्यूशन हो सकता है। हालांकि, सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सीमा को पार करती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी प्राप्त करने के लिए विभिन्न दृष्टिकोण हैं, प्रत्येक विशिष्ट रिज़ॉल्यूशन सीमा के साथ, और प्रत्येक विभिन्न विश्लेषणों के लिए उपयुक्त है। इन दृष्टिकोणों में फोटोएक्टिवेटेड लोकलाइजेशन माइक्रोस्कोपी (पाम) या स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल रिकंस्ट्रक्शन माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म), उत्तेजित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (एसटीईडी), संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम), और एयरिस्कैन (सुपर-रिज़ॉल्यूशन) माइक्रोस्कोपी 38,39,40,41,42,43,44,45,46 शामिल हैं . हालांकि एयरिस्कैन में पाम / स्टॉर्म, एसटीईडी और सिम की तुलना में एक मोटा रिज़ॉल्यूशन है, फिर भी यह ~ 120 एनएम (सीएलएसएम के रिज़ॉल्यूशन से लगभग दोगुना) तक का रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकता है। इसके अलावा, इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण को सिम और अन्य सुपर-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों पर लाभ दिखाया गया है जब कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात47,48 के साथ मोटे नमूने और नमूने इमेजिंग करते हैं।
एयरिस्कैन एक अपेक्षाकृत नई सुपर-रिज़ॉल्यूशन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक46 है। पारंपरिक सीएलएसएम के विपरीत, जो आउट-ऑफ-फोकस लाइट को अस्वीकार करने के लिए पिनहोल और सिंगल पॉइंट डिटेक्टरों का उपयोग करते हैं, यह सुपर-रिज़ॉल्यूशन दृष्टिकोण 32-चैनल गैलियम आर्सेनाइड फॉस्फाइड (जीएएएसपी) फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब एरिया डिटेक्टर का उपयोग करता है जो हर स्कैन स्थिति45 पर सभी प्रकाश एकत्र करता है। 32 डिटेक्टरों में से प्रत्येक एक छोटे पिनहोल के रूप में काम करता है, जो पारंपरिक 1.0 एयरी यूनिट (एयू) से पिनहोल आकार को एक बढ़ाया 0.2 एयू तक कम करता है, जिससे 1.25 एयू व्यास45 की दक्षता बनाए रखते हुए, एक और भी उच्च रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात सक्षम होता है। इसके अलावा, एयरिस्कैन द्वारा उपयोग किए जाने वाले रैखिक विघटन के परिणामस्वरूप रिज़ॉल्यूशन45 में 2x की वृद्धि होती है। इसे ध्यान में रखते हुए, सीएलएसएम, और विशेष रूप से सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, बीएम प्रोटीन और प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल हैं जो बीएम प्रोटीन के बेसल जमाव को विनियमित करते हैं, क्योंकि वे स्थानीयकरण और कोलोकलाइजेशन अध्ययनों के लिए बहुत उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों का उत्पादन कर सकते हैं, जिससे इन प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले स्थानिक, लौकिक और आणविक घटनाओं में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की जा सकती है।
कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण जिसका उपयोग स्थानीयकरण प्रयोगों को करने के लिए किया जा सकता है, वह छवि विघटन है। चूंकि वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी डिटेक्टरों तक पहुंचने के लिए आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश की अनुमति देता है, गणितीय और कम्प्यूटेशनल डिकॉन्वोल्यूशन एल्गोरिदम को वाइडफील्ड माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त छवियों से आउट-ऑफ-फोकस प्रकाश को हटाने या पुन: असाइन करने के लिए लागू किया जा सकता है, जिससे छवि49 के रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट में सुधार होता है। विघटन एल्गोरिदम को रिज़ॉल्यूशन और कंट्रास्ट को और बढ़ाने के लिए कॉन्फोकल छवियों पर भी लागू किया जा सकता है, जिससे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी50 की तुलना में अंतिम छवियां उत्पन्न होती हैं। एयरिस्कैन शेपर्ड के पिक्सेल रीअसाइनमेंट के साथ वीनर फिल्टर-आधारित डिकंवोल्यूशन का उपयोग करता है, जिसके परिणामस्वरूप अत्यधिक बेहतर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन और सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की तुलना में, इस सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीक 45,51 का उपयोग करते समय सभी तीन स्थानिक आयामों (एक्स और वाई में 120 एनएम, और जेड में350 एनएम) में रिज़ॉल्यूशन में 2 एक्स की वृद्धि देखी जाती है।
यह पांडुलिपि कंफोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मित मॉडल सिस्टम के रूप में ड्रोसोफिला अंडाशय के एफई का उपयोग करके बीएम प्रोटीन के इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और जमाव को दागने, प्राप्त करने और कल्पना करने के लिए विस्तृत और अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रदान करती है। अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन को व्यक्त करने वाली ड्रोसोफिला लाइनें, उदाहरण के लिए, वीकेजी-जीएफपी और पीसीएन-जीएफपी, बीएम प्रोटीन तस्करी और स्राव की कल्पना करने के लिए कुशल और सटीक उपकरण हैं। इसके अलावा, उन्हें विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि में आसानी से इस्तेमाल किया जा सकता है, जिसमें उत्परिवर्ती और गैल 4 / यद्यपि अंतर्जात रूप से टैग किए गए तहखाने झिल्ली प्रोटीन की सिफारिश की जाती है, विशिष्ट बीएम प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग भी वर्णित प्रोटोकॉल के साथ संगत है। ये प्रोटोकॉल उन वैज्ञानिकों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हैं जो इंट्रासेल्युलर ट्रैफिकिंग और कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग का उपयोग करके बरकरार उपकला ऊतक में बीएम प्रोटीन के स्राव का अध्ययन करने में रुचि रखते हैं। इसके अलावा, ड्रोसोफिला आनुवंशिकी के विशाल उपकरणों के साथ उपकला ऊतक विश्लेषण को संयोजित करने की क्षमता इस दृष्टिकोण को विशेष रूप से शक्तिशाली बनाती है। अंत में, इन प्रोटोकॉल को आसानी से वेसिकुलर ट्रैफिकिंग और ब्याज के अन्य प्रोटीनों की छंटाई का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बीएम भ्रूण और अंग मॉर्फोजेनेसिस, और वयस्क शारीरिक कार्यों के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बीएम उपकला ध्रुवीयता की स्थापना और रखरखाव के लिए एक सिग्नलिंग प्लेटफॉर्म के रूप में कार्य करता है और ऊतकों क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
पांडुलिपि पर उनकी उपयोगी टिप्पणियों के लिए लेखक जूली मर्कल के आभारी हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान आर 15 जीएम 137236 से ओडी द्वारा समर्थित किया गया था। कॉन्फोकल और सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों को एयरिस्कैन 2 के साथ ज़ीस एलएसएम 900 का उपयोग करके अधिग्रहित किया गया था, जिसे एनएसएफ एमआरआई अनुदान 2018748 के साथ खरीदा गया था।
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
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