Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Summary

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Abstract

La membrana basale (BM) – un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali – è fondamentale per l’istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L’epitelio follicolare dell’ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L’imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l’elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l’identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l’imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell’epitelio follicolare dell’ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l’identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.

Introduction

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi¹. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti ^1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cui la separazione e la barriera dei tessuti, la crescita e il supporto e la polarizzazione cellulare ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12} . Il suo ruolo di piattaforma di segnalazione regola la morfologia e la differenziazione delle cellule epiteliali e dei tessuti durante lo sviluppo ^3,13,14. Inoltre, l’errata regolazione del BM e/o una violazione della sua integrità sono le cause primarie di molte condizioni patologiche, tra cui le metastasi tumorali ^2,15,16. Nonostante le funzioni essenziali svolte dal BM durante la morfogenesi tissutale e d’organo, i componenti delle vie biologiche dedicate al traffico intracellulare polarizzato e alla secrezione di proteine BM sono vagamente note.

Per studiare il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e la secrezione di proteine BM da parte delle cellule epiteliali, l’epitelio follicolare (FE) dell’ovaio Drosophila è un potente sistema modello (Figura 1). Un’ovaia di Drosophila comprende 16-20 strutture lunghe simili a tubi, chiamate ovarioli (Figura 1A,B)17,18,19. Ogni ovariole può essere pensato come una catena di montaggio dell’uovo, con la progressione dell’età delle camere dell’uovo (che danno origine a ciascuna un uovo) che inizia all’estremità anteriore e si muove posteriormente, fino a quando l’uovo maturo esce attraverso l’ovidotto. Ogni camera uovo è incapsulata dal FE, un monostrato di cellule follicolari somatiche (FC), che circonda le cellule germinali centrali (GC). Il FE è altamente polarizzato con una distinta polarità apicale-basale in cui il dominio apicale è rivolto verso la linea germinale e le proteine BM sono secrete basalmente^18,19. I FC secernono attivamente tutti i principali componenti del BM, tra cui Collagen IV, Perlecan e Laminins ^20,21. Nelle cellule epiteliali come le FC, i componenti BM sono prodotti e richiedono una via di secrezione polarizzata specializzata per la loro deposizione extracellulare. Ad esempio, nel caso del componente più abbondante del BM, collagene IV (Coll IV), i dettagli che circondano il suo traffico intracellulare polarizzato e la secrezione sono vaghi nonostante la sua produzione e deposizione siano al centro di molti studi. Coll IV è tradotto nel reticolo endoplasmatico (ER), che è anche dove ogni fibrilla – composta da tre polipeptidi (due catene α1 e una catena α2) – è assemblata in una tripla elica²². Il corretto ripiegamento e funzione di Coll IV richiedono chaperoni ed enzimi ER, tra cui lisil e prolil-idrossilasi come Plod e PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Questi enzimi post-traduzionali regolano lo smistamento ER di Coll IV, poiché la perdita di ciascuno fa sì che Coll IV sia intrappolato nell’ER basale 20,23,24,25,26. Quindi, il Coll IV appena sintetizzato esce dal pronto soccorso per il Golgi in vescicole rivestite copiose. Il recettore di carico Tango1 aiuta a confezionare i collageni in vescicole legate al Golgi di grandi dimensioni che possono ospitare grandi proteine multimeriche^20,27. Una volta che Coll IV è confezionato in vescicole esocitiche intracellulari, viene specificamente secreto basalmente dalle cellule epiteliali. Per dirigere la deposizione di BM sul lato basale, le cellule epiteliali richiedono un altro insieme di fattori specificamente dedicati alla secrezione di BM polarizzata. Utilizzando il FE dell’ovaio Drosophila, sono stati caratterizzati alcuni componenti di questo nuovo processo cellulare, tra cui i fattori di scambio nucleotidico (GEF) Crag e Stratum, le GTPasi Rab8 e Rab10, nonché i livelli del fosfoinositide PI(4,5)P2 e le proteine motorie Kinesin 1 e 3 20,28,29,30,31 . Questi componenti sono fondamentali per garantire la distribuzione polarizzata delle proteine BM.

Per monitorare la localizzazione intracellulare delle proteine BM nella FE, possono essere utilizzate proteine di membrana basale endogenamente marcate (trappole proteiche), come Viking-GFP (Vkg-GFP o α2 Coll IV-GFP) e Perlecan-GFP (Pcan-GFP)^32,33. Queste linee di trappola proteica hanno dimostrato di riflettere accuratamente la distribuzione endogena delle proteine BM e consentono un rilevamento più sensibile del traffico vescicolare^28,30. I componenti coinvolti nella deposizione polarizzata di BM nel FE sono stati inizialmente caratterizzati utilizzando linee di trappola proteica per Vkg-GFP e Pcan-GFP 20,28,29,30. Le trappole proteiche possono essere utilizzate in diversi background genetici, compresi i mutanti e le linee Gal4 ³⁴. Inoltre, le trappole proteiche possono essere utilizzate in combinazione con coloranti fluorescenti e/o immunocolorazione a fluorescenza, consentendo una caratterizzazione precisa della localizzazione delle proteine BM quando si confrontano le condizioni wild-type e mutanti³⁵.

Per valutare in modo accurato ed efficiente la distribuzione e la localizzazione delle vescicole contenenti proteine BM, la microscopia a scansione laser confocale (CLSM) e le tecniche di imaging a super-risoluzione presentano un vantaggio significativo rispetto ad altri approcci di imaging. Questi approcci accoppiano l’imaging ad alta risoluzione con una relativa facilità d’uso. CLSM è una tecnica di microscopia che consente una migliore risoluzione ottica scansionando il campione con un laser in modo raster utilizzando galvanometri. L’apertura stenopeica è un componente fondamentale di un microscopio confocale. Bloccando i segnali fuori fuoco provenienti da sopra o sotto il piano focale, l’apertura stenopeica si traduce in una risoluzione altamente superiore nell’asse z³⁶. Ciò consente anche di ottenere una serie di immagini nel piano z, chiamato z-stack, corrispondente a una serie di sezioni ottiche. Z-stacks crea successivamente un’immagine 3D del campione, tramite ricostruzione 3D, con l’ausilio di software di imaging. I microscopi a epifluorescenza (widefield) convenzionali, a differenza dei microscopi confocali, consentono alla luce sfocata di contribuire alla qualità dell’immagine, diminuendo la risoluzione dell’immagine e il contrasto^36,37. Ciò rende la microscopia a epifluorescenza un candidato meno attraente quando si studia la localizzazione o la colocalizzazione delle proteine.

Sebbene CLSM sia un approccio adatto per varie applicazioni, tra cui l’imaging e la caratterizzazione del traffico intracellulare di proteine BM, presenta ancora un problema quando si visualizzano campioni al di sotto del limite di diffrazione della luce di Abbe (200-250 nm). Quando si esegue l’imaging di tali campioni, la microscopia confocale, specialmente quando si utilizza un obiettivo ad olio, può portare ad un’alta risoluzione. Tuttavia, le tecniche di super-risoluzione superano il limite della microscopia confocale. Esistono vari approcci per ottenere la microscopia a super-risoluzione, ognuno con limiti di risoluzione specifici e ciascuno appropriato per analisi diverse. Questi approcci includono microscopia di localizzazione fotoattivata (PALM) o microscopia di ricostruzione ottica stocastica (STORM), microscopia a deplezione di emissione stimolata (STED), microscopia a illuminazione strutturata (SIM) e microscopia Airyscan (super-risoluzione) 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Sebbene Airyscan abbia una risoluzione più grossolana di PALM / STORM, STED e SIM, può comunque raggiungere una risoluzione fino a ~ 120 nm (circa il doppio della risoluzione di CLSM). Inoltre, questo approccio di microscopia a super-risoluzione ha dimostrato di avere un vantaggio rispetto alla SIM e ad altre tecniche di super-risoluzione quando si visualizzano campioni spessi e campioni con un basso rapporto segnale-rumore^47,48.

Airyscan è una tecnologia di microscopia confocale a super-risoluzione relativamente nuova⁴⁶. A differenza dei CLSM tradizionali, che utilizzano i rilevatori stenopeici e a punto singolo per respingere la luce fuori fuoco, questo approccio a super-risoluzione utilizza un rilevatore di area del tubo fotomoltiplicatore a 32 canali di fosfuro di arseniuro di gallio (GaAsP) che raccoglie tutta la luce in ogni posizione di scansione⁴⁵. Ciascuno dei 32 rivelatori funziona come un piccolo foro stenopeico, riducendo le dimensioni del foro stenopeico dalla tradizionale 1.0 Airy Unit (A.U.) a una maggiore 0.2 A.U., consentendo una risoluzione e un rapporto segnale-rumore ancora più elevati, pur mantenendo l’efficienza di un diametro 1.25 A.U.⁴⁵. Inoltre, la deconvoluzione lineare utilizzata da Airyscan si traduce in un aumento fino a 2 volte della risoluzione⁴⁵. Tenendo conto di ciò, i CLSM, e in particolare la microscopia a super-risoluzione, sono adatti per studiare le proteine BM e le proteine che regolano la deposizione basale delle proteine BM, in quanto possono produrre immagini ad altissima risoluzione per studi di localizzazione e colocalizzazione, fornendo così nuove intuizioni sugli eventi spaziali, temporali e molecolari che controllano questi processi.

Un approccio alternativo alla microscopia confocale che può essere utilizzato per eseguire esperimenti di localizzazione è la deconvoluzione delle immagini. Poiché la microscopia a largo campo consente alla luce fuori fuoco di raggiungere i rivelatori, è possibile applicare algoritmi di deconvoluzione matematica e computazionale per rimuovere o riassegnare la luce fuori fuoco dalle immagini ottenute con la microscopia a campo largo, migliorando così la risoluzione e il contrasto dell’immagine⁴⁹. Gli algoritmi di deconvoluzione possono essere applicati anche alle immagini confocali per aumentare ulteriormente la risoluzione e il contrasto, producendo immagini finali quasi paragonabili a quelle della microscopia a super-risoluzione⁵⁰. Airyscan utilizza la deconvoluzione basata sul filtro Weiner insieme alla riassegnazione dei pixel di Sheppard, con conseguente miglioramento della risoluzione spaziale e del rapporto segnale-rumore. Rispetto alla microscopia confocale, si osserva un aumento di 2 volte della risoluzione in tutte e tre le dimensioni spaziali (120 nm in x e y e 350 nm in z) quando si utilizza questa tecnica di microscopia a super-risoluzione ^45,51.

Questo manoscritto fornisce protocolli dettagliati e ottimizzati per macchiare, acquisire e visualizzare il traffico intracellulare e la deposizione di proteine BM utilizzando il FE dell’ovaio Drosophila come sistema modello accoppiato con microscopia confocale e super-risoluzione. Le linee di Drosophila che esprimono proteine di membrana basale endogenamente etichettate, ad esempio Vkg-GFP e Pcan-GFP, sono strumenti efficienti e accurati per visualizzare il traffico e la secrezione di proteine BM. Inoltre, possono essere facilmente utilizzati in diversi background genetici, tra cui mutanti e Gal4 / UAS linee³⁴. Sebbene si raccomandino proteine di membrana basale marcate endogenamente, l’uso di anticorpi contro specifiche proteine BM è anche compatibile con i protocolli descritti. Questi protocolli sono particolarmente utili per gli scienziati interessati a studiare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM nel tessuto epiteliale intatto utilizzando l’imaging confocale e super-risoluzione. Inoltre, la capacità di combinare l’analisi del tessuto epiteliale con gli strumenti espansivi della genetica Drosophila rende questo approccio particolarmente potente. Infine, questi protocolli potrebbero essere facilmente adattati per studiare il traffico vescicolare e lo smistamento di altre proteine di interesse.

Protocol

1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L’aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in qu…

Representative Results

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell’ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere…

Discussion

Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d’organo e per le funzioni fisiologiche dell’adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l’istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto². Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un…

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing