Drosophila Oogenezi Sırasında Polarize Hücre İçi Kaçakçılığın ve Bazalton Membran Proteinlerinin Sekresyonunun Konfokal ve Süper Rezolüsyonlu Görüntülenmesi
Summary
Bodrum zarı, gelişim sırasında doku ve organ morfogenezi için gereklidir. Bu yapının uygun şekilde yerleştirilmesine yol açan mekanizmaları daha iyi anlamak için, sunulan protokol, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi kullanarak epitel hücrelerinde bazal membran proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek ve karakterize etmek için yöntemleri açıklamaktadır.
Abstract
Epitel hücrelerinin bazal tarafında bulunan özel bir hücre dışı matriks tabakası olan bazal membran (BM), epitel dokusu morfolojisinin ve organ morfogenezinin kurulması ve sürdürülmesi için kritik öneme sahiptir. Dahası, BM doku modellemesi için gereklidir, bir sinyal platformu görevi görür ve dokuları ve organları şekillendirmek için dış kuvvetler sağlar. BM’nin normal gelişim ve patolojik durumlar sırasında oynadığı birçok önemli role rağmen, BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını kontrol eden biyolojik yollar ve bazal sekresyonun BM proteinlerinin polarize birikimine nasıl yol açtığı tam olarak anlaşılamamıştır. Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli, BM membran proteinlerinin bazal birikimini incelemek için mükemmel bir model sistemidir, çünkü BM’nin tüm ana bileşenlerini üretir ve salgılar. sabit dokularda görüntü işleme ile birleştirilen konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme, özellikle BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığı ve birikiminde rol oynayan hücresel faktörlerin tanımlanmasına ve karakterizasyonuna izin verir. Bu makalede, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epitelindeki endojen olarak etiketlenmiş proteinler kullanılarak BM içeren veziküllerin ve biriken BM’nin boyanması ve görüntülenmesi için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu protokol hem kalitatif hem de nicel soruları ele almak için uygulanabilir ve epitel dokusu gelişimi sırasında polarize hücre içi kaçakçılık ve veziküllerin salgılanmasında rol oynayan faktörlerin hızlı ve verimli bir şekilde tanımlanmasına olanak tanıyan yüksek verimli taramaya uyum sağlamak için geliştirilmiştir.
Introduction
Bodrum membranı (BM), epitel yapısı ve morfogenez1 için kritik olan katmanlı hücre yapışık hücre dışı matriksin (ECM) ince bir tabakasıdır. ~ 50 proteinden oluşur ve epitel ve endotel hücrelerinin altında her yerde bulunur ve iskelet, pürüzsüz ve kalp kası hücrelerini ve adipositleri 1,2,3 ile örter. BM’nin epitel hücrelerinin bazal tarafındaki üç ana bileşeni Kollajen IV, Perlekan ve Lamininlerdir. BM, epitel hücrelerinin temelini oluşturur ve doku ayrılması ve bariyeri, büyüme ve destek ve hücre polarizasyonu 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 dahil olmak üzere birçok fonksiyondan sorumludur. . Bir sinyal platformu olarak rolü, gelişim sırasında epitel hücrelerinin ve dokularının morfolojisini ve farklılaşmasını düzenler 3,13,14. Ayrıca, BM’nin yanlış düzenlenmesi ve / veya bütünlüğünün ihlali, tümör metastazı2,15,16 dahil olmak üzere birçok patolojik durumun birincil nedenleridir. BM tarafından doku ve organ morfogenezi sırasında gerçekleştirilen temel fonksiyonlara rağmen, BM proteinlerinin polarize hücre içi kaçakçılığına ve sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların bileşenleri belirsiz olarak bilinmektedir.
BM içeren veziküllerin hücre içi kaçakçılığını ve BM proteinlerinin epitel hücreleri tarafından salgılanmasını incelemek için, Drosophila yumurtalıklarının foliküler epiteli (FE) güçlü bir model sistemdir (Şekil 1). Bir Drosophila yumurtalık, ovaroller adı verilen 16-20 uzun, tüp benzeri yapıdan oluşur (Şekil 1A, B)17,18,19. Her ovarol, ön uçta başlayan ve olgun yumurta kanalından çıkana kadar arkadan hareket eden yumurta odalarının (her biri bir yumurtaya yol açan) yaş ilerlemesiyle bir yumurta montaj hattı olarak düşünülebilir. Her yumurta odası, merkezi germline hücrelerini (GC’ler) çevreleyen somatik folikül hücrelerinin (FC’ler) tek katmanlı bir tabakası olan FE tarafından kapsüllenir. FE, apikal alanın germ hattına baktığı ve BM proteinlerinin bazal olarak18,19 salgılandığı belirgin bir apikal-bazal polarite ile oldukça polarize edilir. FC’ler, Kollajen IV, Perlecan ve Lamininler20,21 dahil olmak üzere BM’nin tüm ana bileşenlerini aktif olarak salgılar. FC’ler gibi epitel hücrelerinde, BM bileşenleri üretilir ve hücre dışı birikimleri için özel bir polarize sekresyon yolu gerektirir. Örneğin, BM’nin en bol bileşeni olan Kollajen IV (Coll IV) söz konusu olduğunda, polarize hücre içi kaçakçılığını ve sekresyonunu çevreleyen detaylar, üretimi ve birikimi birçok çalışmanın odak noktası olmasına rağmen belirsizdir. Coll IV, endoplazmik retikulumda (ER) çevrilir, bu da her fibrilin – üç polipeptitten (iki α1 zinciri ve bir α2 zinciri) oluşan – üçlü bir sarmal22’ye monte edildiği yerdir. Uygun Coll IV katlama ve fonksiyonu, Plod ve PH4αEFB 20,22,23,24,25,26 gibi lizil ve prolil-hidroksilazlar dahil olmak üzere ER şaperonları ve enzimleri gerektirir. Bu posttranslasyonel enzimler, Coll IV’ün ER sıralamasını düzenler, çünkü her birinin kaybı, Coll IV’ün bazal ER20,23,24,25,26’da sıkışmasına neden olur. Daha sonra, yeni sentezlenen Coll IV, COPII kaplı veziküllerde Golgi için ER’den çıkar. Kargo reseptörü Tango1, kollajenlerin büyük multimerik proteinleri barındırabilen büyük Golgi’ye bağlı veziküllere paketlenmesine yardımcı olur20,27. Coll IV, hücre içi ekzositik veziküllere paketlendikten sonra, özellikle epitel hücrelerinden bazal olarak salgılanır. BM birikimini bazal tarafa yönlendirmek için, epitel hücreleri özellikle polarize BM sekresyonuna adanmış başka bir dizi faktöre ihtiyaç duyar. Drosophila yumurtalıklarının FE’sini kullanarak, nükleotid değişim faktörleri (GEF’ler) Crag ve Stratum, GTPazlar Rab8 ve Rab10’un yanı sıra fosfoinositid PI (4,5) P2 seviyeleri ve Kinesin 1 ve 3 motor proteinleri 20,28,29,30,31 dahil olmak üzere bu yeni hücresel sürecin birkaç bileşeni karakterize edilmiştir. . Bu bileşenler, BM proteinlerinin polarize dağılımını sağlamada kritik öneme sahiptir.
FE’deki BM proteinlerinin hücre içi lokalizasyonunu izlemek için, Viking-GFP (Vkg-GFP veya α2 Coll IV-GFP) ve Perlecan-GFP (Pcan-GFP) gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri (protein tuzakları)32,33 kullanılabilir. Bu protein tuzak hatlarının BM proteinlerinin endojen dağılımını doğru bir şekilde yansıttığı ve veziküler kaçakçılığın daha hassas bir şekilde tespit edilmesini sağladığı gösterilmiştir 28,30. FE’de BM’nin polarize birikiminde rol oynayan bileşenler ilk olarak Vkg-GFP ve Pcan-GFP20,28,29,30 için protein tuzak hatları kullanılarak karakterize edildi. Protein tuzakları, mutantlar ve Gal4 hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kullanılabilir. Ayrıca, protein tuzakları floresan boyalar ve / veya floresan immünoboyama ile kombinasyon halinde kullanılabilir, bu da vahşi tip ve mutant koşulları karşılaştırırken BM proteinlerinin lokalizasyonunun kesin karakterizasyonuna izin verir35.
BM proteini içeren veziküllerin dağılımını ve lokalizasyonunu doğru ve verimli bir şekilde değerlendirmek için, konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ve süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri diğer görüntüleme yaklaşımlarına önemli bir avantaj sağlamaktadır. Bu yaklaşımlar, yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi göreceli kullanım kolaylığı ile birleştirir. CLSM, galvanometreler kullanarak numuneyi bir lazerle raster tarama tarzında tarayarak gelişmiş bir optik çözünürlüğe izin veren bir mikroskopi tekniğidir. İğne deliği açıklığı, konfokal mikroskopun temel bir bileşenidir. İğne deliği diyafram açıklığı, odak düzleminin üstünden veya altından gelen odak dışı sinyalleri engelleyerek, z ekseni36’da oldukça üstün bir çözünürlük sağlar. Bu aynı zamanda z-düzleminde, bir dizi optik bölüme karşılık gelen z-yığını adı verilen bir dizi görüntü elde etmeyi mümkün kılar. z-yığınları daha sonra görüntüleme yazılımı yardımıyla 3D rekonstrüksiyon yoluyla numunenin 3D görüntüsünü oluşturur. Geleneksel epifloresan (geniş alan) mikroskoplar, konfokal mikroskopların aksine, odak dışı ışığın görüntü kalitesine katkıda bulunmasına izin vererek görüntü çözünürlüğünü ve kontrastıazaltır 36,37. Bu, epifloresan mikroskopisini protein lokalizasyonu veya kolokalizasyonu üzerinde çalışırken daha az çekici bir aday haline getirir.
CLSM, BM proteinlerinin hücre içi trafiğinin görüntülenmesi ve karakterizasyonu da dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için uygun bir yaklaşım olmasına rağmen, Abbe’nin ışık kırınım sınırının (200-250 nm) altındaki örnekleri görüntülerken hala bir sorun teşkil etmektedir. Bu tür örnekleri görüntülerken, konfokal mikroskopi, özellikle bir yağ hedefi kullanırken, yüksek çözünürlükle sonuçlanabilir. Bununla birlikte, süper çözünürlük teknikleri konfokal mikroskopinin sınırını aşmaktadır. Süper çözünürlüklü mikroskopi elde etmek için, her biri belirli çözünürlük sınırlarına sahip ve her biri farklı analizler için uygun olan çeşitli yaklaşımlar vardır. Bu yaklaşımlar arasında fotoaktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM), uyarılmış emisyon tükenme mikroskobu (STED), yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) ve Airyscan (süper çözünürlük) mikroskobu 38,39,40,41,42,43,44,45,46 bulunmaktadır. . Airyscan, PALM / STORM, STED ve SIM’den daha kaba bir çözünürlüğe sahip olmasına rağmen, yine de ~ 120 nm’ye kadar bir çözünürlüğe ulaşabilir (CLSM’nin çözünürlüğünün yaklaşık iki katı). Ayrıca, bu süper çözünürlüklü mikroskopi yaklaşımının, kalın numuneleri ve düşük sinyal-gürültü oranına sahip numuneleri görüntülerken SIM ve diğer süper çözünürlüklü tekniklere göre bir avantajı olduğu gösterilmiştir47,48.
Airyscan nispeten yeni bir süper çözünürlüklü konfokal mikroskopi teknolojisidir46. Odak dışı ışığı reddetmek için iğne deliği ve tek nokta dedektörlerini kullanan geleneksel CLSM’lerin aksine, bu süper çözünürlüklü yaklaşım, her tarama konumunda tüm ışığı toplayan 32 kanallı galyum arsenit fosfit (GaAsP) fotoçarpan tüp alanı dedektörü kullanır45. 32 dedektörün her biri küçük bir iğne deliği olarak çalışarak iğne deliği boyutunu geleneksel 1,0 Havadar Üniteden (A.U.) gelişmiş 0,2 A.U.’ya düşürerek 1,25 A.U. çapı45’in verimliliğini korurken daha da yüksek bir çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Ayrıca, Airyscan tarafından kullanılan doğrusal dekonvolüsyon,45 çözünürlüğünde 2 kata kadar artışa neden olur. Bunu göz önünde bulundurarak, CLSM ve özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, BM proteinlerinin bazal birikimini düzenleyen BM proteinlerini ve proteinlerini incelemek için çok uygundur, çünkü lokalizasyon ve kolokalizasyon çalışmaları için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler üretebilirler, böylece bu süreçleri kontrol eden mekansal, zamansal ve moleküler olaylarda yeni bilgiler sağlayabilirler.
Lokalizasyon deneyleri yapmak için kullanılabilecek konfokal mikroskopiye alternatif bir yaklaşım, görüntü dekonvolüsyonudur. Geniş alan mikroskobu, odak dışı ışığın dedektörlere ulaşmasına izin verdiğinden, geniş alan mikroskobu ile elde edilen görüntülerden odak dışı ışığı çıkarmak veya yeniden atamak için matematiksel ve hesaplamalı dekonvolüsyon algoritmaları uygulanabilir, böylece görüntünün çözünürlüğünü ve kontrastını artırabilir49. Dekonvolüsyon algoritmaları, çözünürlüğü ve kontrastı daha da artırmak için konfokal görüntülere de uygulanabilir ve neredeyse süper çözünürlüklü mikroskopi50 ile karşılaştırılabilir nihai görüntüler üretir. Airyscan, Sheppard’ın piksel yeniden atamasıyla birlikte Weiner filtre tabanlı dekonvolüsyondan yararlanır ve bu da oldukça gelişmiş bir uzamsal çözünürlük ve sinyal-gürültü oranı sağlar. Konfokal mikroskopi ile karşılaştırıldığında, bu süper çözünürlüklü mikroskopi tekniği 45,51 kullanıldığında, her üç uzamsal boyutta (x ve y’de 120 nm ve z’de350 nm) çözünürlükte 2 kat artış gözlenmiştir.
Bu makale, konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskopi ile birleştirilmiş bir model sistem olarak Drosophila yumurtalık FE’sini kullanarak BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığını ve birikimini boyamak, elde etmek ve görselleştirmek için ayrıntılı ve optimize edilmiş protokoller sunmaktadır. Vkg-GFP ve Pcan-GFP gibi endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinlerini ifade eden Drosophila çizgileri, BM protein kaçakçılığını ve sekresyonunu görselleştirmek için etkili ve doğru araçlardır. Ek olarak, mutant ve Gal4 / UAS hatları34 dahil olmak üzere farklı genetik arka planlarda kolayca kullanılabilirler. Endojen olarak etiketlenmiş bazal membran proteinleri önerilmekle birlikte, spesifik BM proteinlerine karşı antikorların kullanımı da tarif edilen protokollerle uyumludur. Bu protokoller, konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüleme kullanarak hücre içi kaçakçılığı ve bozulmamış epitel dokusunda BM proteinlerinin salgılanmasını incelemek isteyen bilim adamları için özellikle yararlıdır. Dahası, epitel doku analizini Drosophila genetiğinin geniş araçlarıyla birleştirme yeteneği, bu yaklaşımı özellikle güçlü kılmaktadır. Son olarak, bu protokoller veziküler kaçakçılığı ve ilgilenilen diğer proteinlerin sıralanmasını incelemek için kolayca uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
BM, embriyonik ve organ morfogenezi ve yetişkin fizyolojik fonksiyonları için kritik öneme sahiptir. Ayrıca, BM, epitel polaritesinin kurulması ve sürdürülmesi için bir sinyal platformu görevi görür ve dokulara destek2 sağlar. Bununla birlikte, BM proteinlerinin uygun şekilde yerleştirilmesini düzenleyen mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. BM proteinlerinin hücre içi kaçakçılığına ve polarize sekresyonuna adanmış biyolojik yolakların daha iyi anlaşılması, …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, Julie Merkle’ye el yazması hakkındaki yararlı yorumları için minnettardır. Bu çalışma, O.D.’ye NIH hibe R15GM137236 tarafından desteklenmiştir. Konfokal ve süper çözünürlüklü görüntüler, NSF MRI hibe 2018748 ile satın alınan Airyscan 2’li bir Zeiss LSM 900 kullanılarak elde edildi.
Materials
| Alexa Fluor 546 phalloidin | Invitrogen | A22283 | F-Actin Stain (1/500 of 66µM) |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Invitrogen | A22287 | F-Actin Stain (1/100 of 66µM)) |
| Anti-GM130 Antibody | abcam | ab30637 | For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL |
| Aqua-Polymount | Polysciences, Inc. | 1860620 | Mounting Medium |
| Bakers Yeast (Active Dry Yeast) | Genesee Scientific | 62-103 | To fatten the overies for dissection |
| Bovine Serum Albumin (30% solution) | Sigma-Aldrich | A7284 | For blocking solution |
| Depression wells | Electron Microscopy Sciences | 7156101 | For dissection (glass concavity slide can be used instead) |
| Dissecting needle | Fisher scientifc | 13-820-024 | |
| Drosophila Incubator | Genesee Scientific/Invictus | ||
| Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700) | Morin et al., 2001 | ||
| Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241) | Bloomington Drosophila Stock Center | 33594 | RNAi against Crag |
| Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791) | Buszczak et al., 2007 | ||
| Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4 | Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE | ||
| Forceps (Dumont 5) | Fine Science Tools | 11251-30 | For dissection |
| Glass Concavity Slide | Electron Microscopy Sciences | 7187804 | For dissection (depression wells can be used instead) |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11036 | Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL) |
| Hoechst (Hoechst 33342) | Invitrogen | H3570 | DNA Stain (1 ug/mL) |
| Kimwipes | Kimtech | Fisher Scientific: 06-666 | Delicate task wipers |
| Leica Fluorescent Stereo Microscope M165 FC | Leica | For ovary imaging | |
| Microscope Slides | Corning | 294875X25 | Microscope Slides |
| Nutating platform rocker | Corning Life Sciences | 6720 | For ovary fixation and staining |
| Nutri-Fly BF | Genesee Scientific | 66-121 | Fly Food |
| Paraformaldehyde 20% Solution | Electron Microscopy Sciences | Fisher Scientific: 15713 | For PFA 4% |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher scientific | BP2944100 | For PBS solution |
| ProLong Glass Antifade Mountant | Invitrogen | P36980 | Mounting Medium |
| Square Cover Glass | Corning | 285022 | Cover glass for microscope slides |
| Triton x-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 | For PBST |
| Zeiss LSM 900 with Airyscan 2 | Zeiss | Confocal and super-resolution Microscope | |
| Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope | Zeiss | Dissecting microscope | |
| Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition) | Zeiss | Image acquisition and processing |
Riferimenti
- Halfter, W., et al. New concepts in basement membrane biology. FEBS Journal. 282 (23), 4466-4479 (2015).
- Sekiguchi, R., Yamada, K. M. Basement membranes in development and disease. Current Topics in Developmental Biology. 130, 143-191 (2018).
- Jayadev, R., Sherwood, D. R. Basement membranes. Current Biology. 27 (6), 207-211 (2017).
- Engelhardt, B., Vajkoczy, P., Weller, R. O. The movers and shapers in immune privilege of the CNS. Nature Immunology. 18 (2), 123-131 (2017).
- Kefalides, N., Borel, J. Functions of basement membranes. Current Topics in Membranes. 56, 79-111 (2005).
- Kefalides, N., Borel, J. Basement membranes in development. Current Topics in Membranes. 56, 43-77 (2005).
- Halfter, W., et al. The bi-functional organization of human basement membranes. PLoS One. 8 (7), 67660 (2013).
- Morrissey, M. A., Sherwood, D. R. An active role for basement membrane assembly and modification in tissue sculpting. Journal of Cell Science. 128 (9), 1661-1668 (2015).
- Miller, R. T. Mechanical properties of basement membrane in health and disease. Matrix Biology. 57-58, 366-373 (2017).
- Mak, K. M., Mei, R. Basement membrane type IV collagen and laminin: An overview of their biology and value as fibrosis biomarkers of liver disease. Anatomical Record. 300 (8), 1371-1390 (2017).
- Fukumoto, S., et al. Laminin α5 is required for dental epithelium growth and polarity and the development of tooth bud and shape. Journal of Biological Chemistry. 281 (8), 5008-5016 (2006).
- Plachot, C., et al. Factors necessary to produce basoapical polarity in human glandular epithelium formed in conventional and high-throughput three-dimensional culture: Example of the breast epithelium. BMC Biology. 7, 77 (2009).
- Bonnans, C., Chou, J., Werb, Z. Remodelling the extracellular matrix in development and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (12), 786-801 (2014).
- Loscertales, M., et al. Type IV collagen drives alveolar epithelial-endothelial association and the morphogenetic movements of septation. BMC Biology. 14, 59 (2016).
- Kalluri, R. Basement membranes: Structure, assembly and role in tumour angiogenesis. Nature Reviews Cancer. 3 (6), 422-433 (2003).
- Royer, C., Lu, X. Epithelial cell polarity: A major gatekeeper against cancer. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1470-1477 (2011).
- McLaughlin, J. M., Bratu, D. P. Drosophila melanogaster oogenesis: An overview. Methods in Molecular Biology. 1328, 1-20 (2015).
- Wu, X., Tanwar, P. S., Raftery, L. A. Drosophila follicle cells: morphogenesis in an eggshell. Seminars in Cell & Developmental Biology. 19 (3), 271-282 (2008).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: Epithelial morphogenesis in theDrosophila egg chamber. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 559-574 (2005).
- Lerner, D. W., et al. A Rab10-dependent mechanism for polarized basement membrane secretion during organ morphogenesis. Developmental Cell. 24 (2), 159-168 (2013).
- Schneider, M., et al. Perlecan and Dystroglycan act at the basal side of the Drosophila follicular epithelium to maintain epithelial organization. Development. 133 (19), 3805-3815 (2006).
- Mao, M., Alavi, M. V., Labelle-Dumais, C., Gould, D. B. Type IV collagens and basement membrane diseases: Cell biology and pathogenic mechanisms. Current Topics in Membranes. 76, 61-116 (2015).
- Myllylä, R., et al. Expanding the lysyl hydroxylase toolbox: new insights into the localization and activities of lysyl hydroxylase 3 (LH3). Journal of Cellular Physiology. 212 (2), 323-329 (2007).
- Myllyharju, J., Kivirikko, K. I. Collagens, modifying enzymes and their mutations in humans, flies and worms. Trends in Genetics: TIG. 20 (1), 33-43 (2004).
- Norman, K. R., Moerman, D. G. The let-268 locus of Caenorhabditis elegans encodes a procollagen lysyl hydroxylase that is essential for type IV collagen secretion. Biologia dello sviluppo. 227 (2), 690-705 (2000).
- Rautavuoma, K., et al. Premature aggregation of type IV collagen and early lethality in lysyl hydroxylase 3 null mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (39), 14120-14125 (2004).
- Saito, K., et al. TANGO1 facilitates cargo loading at endoplasmic reticulum exit sites. Cell. 136 (5), 891-902 (2009).
- Denef, N., et al. Crag regulates epithelial architecture and polarized deposition of basement membrane proteins in Drosophila. Developmental Cell. 14 (3), 354-364 (2008).
- Devergne, O., Sun, G. H., Schüpbach, T. Stratum, a homolog of the human GEF Mss4, partnered with Rab8, controls the basal restriction of basement membrane proteins in epithelial cells. Cell Reports. 18 (8), 1831-1839 (2017).
- Devergne, O., Tsung, K., Barcelo, G., Schüpbach, T. Polarized deposition of basement membrane proteins depends on Phosphatidylinositol synthase and the levels of Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7689-7694 (2014).
- Zajac, A. L., Horne-Badovinac, S. Kinesin-directed secretion of basement membrane proteins to a subdomain of the basolateral surface in Drosophila epithelial cells. Current Biology: CB. 32 (4), 735-748 (2022).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (26), 15050 (2001).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetica. 175 (3), 1505-1531 (2007).
- Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the fly: A primer on the drosophila model system. Genetica. 201 (3), 815-842 (2015).
- Dunst, S., Tomancak, P. Imaging flies by fluorescence microscopy: Principles, technologies, and applications. Genetica. 211 (1), 15-34 (2019).
- Elliott, A. D. Confocal Microscopy: Principles and Modern Practices. Current Protocols in Cytometry. 92 (1), 68 (2020).
- Sanderson, M. J., Smith, I., Parker, I., Bootman, M. D. Fluorescence microscopy. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (10), (2014).
- Liu, S., Huh, H., Lee, S. H., Huang, F. Three-dimensional single-molecule localization microscopy in whole-cell and tissue specimens. Annual Review of Biomedical Engineering. 22, 155-184 (2020).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- Huang, B., Babcock, H., Zhuang, X. Breaking the diffraction barrier: Super-resolution imaging of cells. Cell. 143 (7), 1047-1058 (2010).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Heintzmann, R., Huser, T. Super-resolution structured illumination microscopy. Chemical Reviews. 117 (23), 13890-13908 (2017).
- Müller, T., Schumann, C., Kraegeloh, A. STED microscopy and its applications: new insights into cellular processes on the nanoscale. Chemphyschem: A. European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13 (8), 1986-2000 (2012).
- Feng, H., Wang, X., Xu, Z., Zhang, X., Gao, Y. Super-resolution fluorescence microscopy for single cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1068, 59-71 (2018).
- Huff, J. The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution. Nature Methods. 12, (2015).
- Wu, X., Hammer, J. A. ZEISS Airyscan: Optimizing usage for fast, gentle, super-resolution imaging. Methods in Molecular Biology. 2304, 111-130 (2021).
- Sivaguru, M., et al. Comparative performance of airyscan and structured illumination superresolution microscopy in the study of the surface texture and 3D shape of pollen. Microscopy Research and Technique. 81 (2), 101-114 (2018).
- Tröger, J., et al. Comparison of multiscale imaging methods for brain research. Cells. 9 (6), 1377 (2020).
- Zhang, W., et al. Virtual single-pixel imaging-based deconvolution method for spatial resolution improvement in wide-field fluorescence microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (7), 3648 (2020).
- He, T., Sun, Y., Qi, J., Hu, J., Huang, H. Image deconvolution for confocal laser scanning microscopy using constrained total variation with a gradient field. Applied Optics. 58 (14), 3754 (2019).
- Korobchevskaya, K., Lagerholm, B. C., Colin-York, H., Fritzsche, M. Exploring the Potential of Airyscan Microscopy for Live Cell Imaging. Photonics. 4 (3), 41 (2017).
- Pulver, S. R., Berni, J. The fundamentals of flying: Simple and inexpensive strategies for employing drosophila genetics in neuroscience teaching laboratories. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 11 (1), 139-148 (2012).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of drosophila ovaries. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (1), e52 (2006).
- Hudson, A. M., Cooley, L. Methods for studying oogenesis. Methods. 68 (1), 207-217 (2014).
- Thompson, L., Randolph, K., Norvell, A. Basic techniques in drosophila ovary preparation. Methods in Molecular Biology. 1328, 21-28 (2015).
- Long, D. E., et al. A guide for using NIH Image J for single slice cross-sectional area and composition analysis of the thigh from computed tomography. PLoS One. 14 (2), 0211629 (2019).
- Cetera, M., Lewellyn, L., Horne-Badovinac, S. Cultivation and live imaging of drosophila ovaries. Methods in Molecular Biology. 1478, 215-226 (2016).
- Bier, E., et al. Advances in engineering the fly genome with the CRISPR-Cas system. Genetica. 208 (1), 1-18 (2018).
