Imaging confocale e a super-risoluzione del traffico intracellulare polarizzato e della secrezione di proteine della membrana basale durante l'oogenesi della drosophila

Summary

La membrana basale è essenziale per la morfogenesi dei tessuti e degli organi durante lo sviluppo. Per comprendere meglio i meccanismi che portano al corretto posizionamento di questa struttura, il protocollo presentato descrive i metodi per visualizzare e caratterizzare il traffico intracellulare e la secrezione di proteine della membrana basale nelle cellule epiteliali utilizzando la microscopia confocale e super-risoluzione.

Abstract

La membrana basale (BM) - un foglio specializzato di matrice extracellulare presente sul lato basale delle cellule epiteliali - è fondamentale per l'istituzione e il mantenimento della morfologia del tessuto epiteliale e della morfogenesi degli organi. Inoltre, il BM è essenziale per la modellazione dei tessuti, fungendo da piattaforma di segnalazione e fornendo forze esterne per modellare tessuti e organi. Nonostante i molti ruoli importanti che il BM svolge durante il normale sviluppo e le condizioni patologiche, le vie biologiche che controllano il traffico intracellulare di vescicole contenenti BM e come la secrezione basale porta alla deposizione polarizzata delle proteine BM sono scarsamente comprese. L'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila è un eccellente sistema modello per studiare la deposizione basale delle proteine di membrana BM, in quanto produce e secerne tutti i principali componenti del BM. L'imaging confocale e a super-risoluzione combinato con l'elaborazione delle immagini in tessuti fissi consente l'identificazione e la caratterizzazione di fattori cellulari specificamente coinvolti nel traffico intracellulare e nella deposizione di proteine BM. Questo articolo presenta un protocollo dettagliato per la colorazione e l'imaging di vescicole contenenti BM e BM depositato utilizzando proteine marcate endogenamente nell'epitelio follicolare dell'ovaio Drosophila . Questo protocollo può essere applicato per affrontare questioni sia qualitative che quantitative ed è stato sviluppato per ospitare lo screening ad alto rendimento, consentendo l'identificazione rapida ed efficiente dei fattori coinvolti nel traffico intracellulare polarizzato e nella secrezione di vescicole durante lo sviluppo del tessuto epiteliale.

Introduction

La membrana basale (BM) è un sottile foglio di matrice extracellulare aderente alle cellule stratificate (ECM) fondamentale per la struttura epiteliale e la morfogenesi¹. Comprende ~ 50 proteine e si trova ubiquitariamente alla base delle cellule epiteliali ed endoteliali e delle cellule del muscolo scheletrico, liscio e cardiaco e degli adipociti ^1,2,3. I tre componenti principali del BM sul lato basale delle cellule epiteliali sono Collagen IV, Perlecan e Laminine. Il BM è alla base delle cellule epiteliali ed è responsabile di molte funzioni, tra cu....

Protocol

1. Preparazione della mosca per le dissezioni ovariche

1. Mettere 10-15 mosche femmine di Drosophila melanogaster (1-2 giorni) del genotipo desiderato in una fiala stretta contenente ~ 8 mL di Drosophila fly medium cosparsa con una piccola quantità di lievito di birra granulato 2-3 giorni prima della dissezione a 25 °C. L'aggiunta di alcuni maschi alla fiala può aumentare la resa della camera delle uova. Tuttavia, assicurarsi che il numero totale di mosche non superi 20 in quanto ciò può influire negativamente sullo sviluppo delle ovaie.
   NOTA: Descrizione di Maschi e femmine di Drosophila e consigli utili e consig....

Results

I metodi qui descritti possono essere utilizzati per visualizzare e caratterizzare in modo efficiente e accurato il traffico intracellulare e la secrezione di proteine BM in cellule epiteliali polarizzate, come la FE dell'ovaio Drosophila . Successivamente, forniamo i risultati attesi ottenuti utilizzando i metodi descritti, nonché consigli utili e potenziali insidie. Per fare ciò, viene utilizzato Vkg-GFP, un Vkg endogenamente taggato (Drosophila Col IV). Tuttavia, gli stessi risultati possono essere o.......

Discussion

Il BM è fondamentale per la morfogenesi embrionale e d'organo e per le funzioni fisiologiche dell'adulto. Inoltre, il BM funge da piattaforma di segnalazione per l'istituzione e il mantenimento della polarità epiteliale e fornisce ai tessuti supporto². Tuttavia, i meccanismi che regolano il corretto posizionamento delle proteine BM sono poco conosciuti. Una migliore comprensione dei percorsi biologici dedicati al traffico intracellulare e alla secrezione polarizzata delle proteine BM richiede un'a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 546 falloidina	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 di 66µ M)
Alexa Fluor 647 falloidina	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 di 66µ M))
Anticorpo Anti-GM130	abcam	ab30637	per la colorazione del Golgi (colocalizzazione); uso come concentrazione di 7µ g/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mezzo di montaggio
Lievito per panettieri (lievito secco attivo)	Genesee Scientific	62-103	Per ingrassare le overies per la dissezione
Albumina sierica bovina (soluzione al 30%)	Sigma-Aldrich	A7284	Per la soluzione bloccante
Pozzetti di depressione	Microscopia elettronica	7156101	Per la dissezione (al suo posto può essere utilizzato un vetrino di concavità)
Ago da dissezione	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi contro Crag
Azioni di mosca: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Azioni di mosche: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Guidare l'espressione dell'RNAi della falesia nelle
pinze FE (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	Per la dissezione
Vetrino per concavità Microscopia	elettronica Scienze	7187804	Per la dissezione (al loro posto possono essere utilizzati pozzetti di depressione)
Capra anti-coniglio IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Anticorpo secondario (anticorpo GM130) (5 &; g/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Tergicristalli per attività delicate
Stereomicroscopio fluorescente Leica  M165 FC	Leica		Per l'imaging delle ovaie
Vetrini per microscopio	Corning	294875X25	Vetrini per microscopio
Piattaforma di nutazione a bilanciere	Corning Life Sciences	6720	Per la fissazione e la colorazione delle ovaie
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldeide 20% Soluzione	Microscopia elettronica Scienze	Fisher Scientifico: 15713	Per PFA 4%
Compresse Saline Tamponate con Fosfato	Fisher	scientific BP2944100	Per soluzione
PBS ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Montaggio Quadrato Medio
Copertura in vetro	Corning	285022	Vetro di copertura per vetrini per microscopio
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	Per PBST
Zeiss LSM 900 con Airyscan 2	Microscopio confocale e super-risoluzione	Zeiss
Stereomicroscopio Stemi 305 Microscopio	dissezione	Zeiss Zeiss
Zen Software versione 3.3 (Blue Edition)	Acquisizione ed elaborazione delle immagini	Zeiss