Konfokal og superopløsningsbilleddannelse af polariseret intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner under Drosophila oogenese

Summary

Kældermembranen er afgørende for vævs- og organmorfogenese under udvikling. For bedre at forstå de mekanismer, der fører til korrekt placering af denne struktur, beskriver den præsenterede protokol metoder til at visualisere og karakterisere intracellulær handel og sekretion af kældermembranproteiner i epitelceller ved hjælp af konfokal og superopløsningsmikroskopi.

Abstract

Kældermembranen (BM) – et specialiseret ark ekstracellulær matrix til stede på den basale side af epitelceller – er afgørende for etablering og vedligeholdelse af epitelvævsmorfologi og organmorfogenese. Desuden er BM afgørende for vævsmodellering, der fungerer som en signalplatform og giver eksterne kræfter til at forme væv og organer. På trods af de mange vigtige roller, som BM spiller under normal udvikling og patologiske tilstande, er de biologiske veje, der styrer den intracellulære handel med BM-holdige vesikler, og hvordan basal sekretion fører til polariseret aflejring af BM-proteiner, dårligt forstået. Drosophila-æggestokkens follikulære epitel er et fremragende modelsystem til at studere den basale aflejring af BM-membranproteiner, da det producerer og udskiller alle hovedkomponenter i BM. Konfokal og superopløsningsbilleddannelse kombineret med billedbehandling i faste væv muliggør identifikation og karakterisering af cellulære faktorer, der specifikt er involveret i intracellulær handel og aflejring af BM-proteiner. Denne artikel præsenterer en detaljeret protokol til farvning og billeddannelse af BM-holdige vesikler og deponeret BM ved hjælp af endogent mærkede proteiner i follikulært epitel i Drosophila-æggestokken . Denne protokol kan anvendes til at løse både kvalitative og kvantitative spørgsmål, og den blev udviklet til at imødekomme screening med høj kapacitet, hvilket muliggør hurtig og effektiv identifikation af faktorer involveret i polariseret intracellulær handel og udskillelse af vesikler under epitelvævsudvikling.

Introduction

Kældermembranen (BM) er et tyndt ark af lagdelt celleadhærent ekstracellulær matrix (ECM), der er kritisk for epitelstruktur og morfogenese¹. Det består af ~ 50 proteiner og findes allestedsnærværende underliggende epitel- og endotelcellerne og indhyller skelet-, glatte- og hjertemuskelceller og adipocytter ^1,2,3. De tre hovedkomponenter i BM på den basale side af epitelcellerne er kollagen IV, perlecan og lamininer. BM ligger til grund for epitelcellerne og er ansvarlig for mange funktioner, herunder vævsseparation og barriere, vækst og støtte og cellepolarisering 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Dens rolle som signalplatform regulerer morfologien og differentieringen af epitelceller og væv under udvikling ^3,13,14. Desuden er misregulering af BM og / eller et brud på dets integritet de primære årsager til mange patologiske tilstande, herunder tumormetastase ^2,15,16. På trods af de væsentlige funktioner, der udføres af BM under vævs- og organmorfogenese, er komponenterne i den biologiske vej (er) dedikeret til polariseret intracellulær handel og sekretion af BM-proteiner vagt kendt.

For at studere den intracellulære handel med BM-holdige vesikler og udskillelsen af BM-proteiner af epitelceller er follikulært epitel (FE) i Drosophila-æggestokken et kraftfuldt modelsystem (figur 1). En Drosophila æggestok består af 16-20 lange, rørlignende strukturer, kaldet ovarioler (figur 1A,B)17,18,19. Hver ovariole kan betragtes som et æg samlebånd, med alder progression af ægkamre (som hver giver anledning til et æg), der begynder i den forreste ende og bevæger sig bagud, indtil det modne æg går ud gennem ovidukten. Hvert ægkammer er indkapslet af FE, et monolag af somatiske follikelceller (FC’er), der omgiver de centrale kimlinjeceller (GC’er). FE er stærkt polariseret med en tydelig apikal-basal polaritet, hvor det apikale domæne vender mod kimlinjen, og BM-proteinerne udskilles basalt ^18,19. FCs udskiller aktivt alle de vigtigste komponenter i BM, herunder Collagen IV, Perlecan og Laminins^20,21. I epitelceller såsom FC’er produceres BM-komponenterne og kræver en specialiseret polariseret sekretionsvej til deres aflejring ekstracellulært. For eksempel i tilfælde af den mest rigelige komponent i BM, Collagen IV (Coll IV), er detaljerne omkring dens polariserede intracellulære handel og sekretion vage på trods af at dens produktion og aflejring er fokus for mange undersøgelser. Coll IV oversættes i det endoplasmatiske retikulum (ER), hvilket også er hvor hver fibril – sammensat af tre polypeptider (to α1-kæder og en α2-kæde) – samles i en tredobbelt helix²². Korrekt Coll IV-foldning og funktion kræver ER-chaperoner og enzymer, herunder lysyl- og prolylhydroxylaser såsom Plod og PH4αEFB 20,22,23,24,25,26. Disse posttranslationelle enzymer regulerer ER-sorteringen af Coll IV, da tabet af hver forårsager, at Coll IV bliver fanget i basal ER 20,23,24,25,26. Derefter forlader nyligt syntetiseret Coll IV ER for Golgi i COPII-belagte vesikler. Lastreceptoren Tango1 hjælper med at pakke kollagener i betydelige Golgi-bundne vesikler, der kan rumme store multimere proteiner^20,27. Når Coll IV er pakket i intracellulære eksocytiske vesikler, udskilles det specifikt basalt fra epitelceller. For at lede BM-aflejring til basalsiden kræver epitelceller et andet sæt faktorer, der specifikt er dedikeret til polariseret BM-sekretion. Ved hjælp af FE af Drosophila æggestokken er nogle få komponenter i denne nye cellulære proces blevet karakteriseret, herunder nukleotidudvekslingsfaktorerne (GEFs) Crag og Stratum, GTPaserne Rab8 og Rab10 samt niveauerne af phosphoinositide PI (4,5) P2 og Kinesin 1 og 3 motorproteiner 20,28,29,30,31 . Disse komponenter er afgørende for at sikre den polariserede fordeling af BM-proteiner.

For at overvåge den intracellulære lokalisering af BM-proteiner i FE kan endogent mærkede kældermembranproteiner (proteinfælder), såsom Viking-GFP (Vkg-GFP eller α2 Coll IV-GFP) og Perlecan-GFP (Pcan-GFP) anvendes^32,33. Disse proteinfældelinjer har vist sig nøjagtigt at afspejle den endogene fordeling af BM-proteiner og muliggøre mere følsom påvisning af vesikulær handel^28,30. Komponenterne involveret i den polariserede aflejring af BM i FE blev først karakteriseret ved hjælp af proteinfældelinjer til Vkg-GFP og Pcan-GFP 20,28,29,30. Proteinfælder kan bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutanter og Gal4 linjer³⁴. Desuden kan proteinfælder anvendes i kombination med fluorescerende farvestoffer og/eller fluorescensimmunopstaining, hvilket muliggør præcis karakterisering af lokaliseringen af BM-proteiner, når man sammenligner vildtype og mutantbetingelser³⁵.

For nøjagtigt og effektivt at vurdere distributionen og lokaliseringen af BM-proteinholdige vesikler udgør konfokal laserscanningsmikroskopi (CLSM) og billeddannelsesteknikker med superopløsning en betydelig fordel for andre billeddannelsesmetoder. Disse tilgange kobler billedbehandling i høj opløsning med relativ brugervenlighed. CLSM er en mikroskopiteknik, der giver mulighed for en forbedret optisk opløsning ved at scanne prøven med en laser på en rasterscannings måde ved hjælp af galvanometre. Pinhole blænden er en kernekomponent i et konfokalt mikroskop. Ved at blokere de ude af fokussignaler, der kommer ovenfra eller under brændplanet, resulterer pinhole-blænden i en meget overlegen opløsning i z-aksen³⁶. Dette gør det også muligt at opnå en række billeder i z-planet, kaldet en z-stak, svarende til en række optiske sektioner. z-stacks skaber efterfølgende et 3D-billede af prøven via 3D-rekonstruktion ved hjælp af billedbehandlingssoftware. Konventionelle epifluorescensmikroskoper (widefield), i modsætning til konfokale mikroskoper, tillader lys uden for fokus at bidrage til billedkvalitet, faldende billedopløsning og kontrast^36,37. Dette gør epifluorescensmikroskopi til en mindre attraktiv kandidat, når man studerer proteinlokalisering eller kolonisering.

Selvom CLSM er en passende tilgang til forskellige applikationer, herunder billeddannelse og karakterisering af den intracellulære handel med BM-proteiner, udgør det stadig et problem, når der afbildes prøver under Abbes diffraktionsgrænse for lys (200-250 nm). Ved billeddannelse af sådanne prøver kan konfokal mikroskopi, især ved brug af et oliemål, resultere i høj opløsning. Superopløsningsteknikker overstiger imidlertid grænsen for konfokal mikroskopi. Der er forskellige tilgange til at opnå superopløsningsmikroskopi, hver med specifikke opløsningsgrænser, og hver passende til forskellige analyser. Disse tilgange omfatter fotoaktiveret lokaliseringsmikroskopi (PALM) eller stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (STORM), stimuleret emissionsudtømningsmikroskopi (STED), struktureret belysningsmikroskopi (SIM) og Airyscan (superopløsning) mikroskopi 38,39,40,41,42,43,44,45,46 . Selvom Airyscan har en grovere opløsning end PALM/STORM, STED og SIM, kan den stadig opnå en opløsning på op til ~120 nm (ca. det dobbelte af CLSM’s opløsning). Desuden har denne superopløsningsmikroskopimetode vist sig at have en fordel i forhold til SIM og andre superopløsningsteknikker ved billeddannelse af tykke prøver og prøver med et lavt signal/støj-forhold ^47,48.

Airyscan er en relativt ny superopløsning konfokal mikroskopiteknologi⁴⁶. I modsætning til traditionelle CLSM’er, der bruger pinhole- og enkeltpunktsdetektorer til at afvise lys, der er ude af fokus, bruger denne superopløsningsmetode en 32-kanals galliumarsenidphosphid (GaAsP) fotomultiplierrørområdedetektor, der samler alt lyset ved hver scanningsposition⁴⁵. Hver af de 32 detektorer fungerer som et lille pinhole, hvilket reducerer pinhole-størrelsen fra den traditionelle 1.0 Airy Unit (A.U.) til en forbedret 0.2 A.U., hvilket muliggør en endnu højere opløsning og signal-støj-forhold, samtidig med at effektiviteten af en 1.25 A.U. diameter⁴⁵ opretholdes. Desuden resulterer den lineære dekonvolution, der anvendes af Airyscan, i op til en 2x stigning i opløsning⁴⁵. Under hensyntagen til dette er CLSM, og specifikt superopløsningsmikroskopi, velegnet til at studere BM-proteiner og proteiner, der regulerer den basale aflejring af BM-proteiner, da de kan producere billeder i meget høj opløsning til lokaliserings- og koloniseringsundersøgelser og derved give ny indsigt i de rumlige, tidsmæssige og molekylære begivenheder, der styrer disse processer.

En alternativ tilgang til konfokal mikroskopi, der kan bruges til at udføre lokaliseringseksperimenter, er billeddekonvolution. Da widefield-mikroskopi gør det muligt for lys, der ikke er i fokus, at nå detektorerne, kan matematiske og beregningsmæssige dekonvolutionsalgoritmer anvendes til at fjerne eller omfordele lys uden for fokus fra billeder opnået ved widefield-mikroskopi og derved forbedre billedets opløsning og kontrast⁴⁹. Dekonvolutionsalgoritmer kan også anvendes på konfokale billeder for yderligere at øge opløsning og kontrast, hvilket producerer endelige billeder, der næsten kan sammenlignes med superopløsningsmikroskopi⁵⁰. Airyscan gør brug af Weiner filterbaseret dekonvolution sammen med Sheppards pixelomplacering, hvilket resulterer i en stærkt forbedret rumlig opløsning og signal-støj-forhold. Sammenlignet med konfokal mikroskopi observeres en stigning på 2x i opløsning i alle tre rumlige dimensioner (120 nm i x og y og 350 nm i z) ved anvendelse af denne superopløsningsmikroskopiteknik^45,51.

Dette manuskript giver detaljerede og optimerede protokoller til at plette, erhverve og visualisere den intracellulære handel og aflejring af BM-proteiner ved hjælp af FE af Drosophila-æggestokken som et modelsystem kombineret med konfokal og superopløsningsmikroskopi. Drosophila-linjer , der udtrykker endogent mærkede kældermembranproteiner, fx Vkg-GFP og Pcan-GFP, er effektive og nøjagtige værktøjer til at visualisere BM-proteinhandel og sekretion. Derudover kan de let bruges i forskellige genetiske baggrunde, herunder mutant og Gal4 / UAS linjer³⁴. Selvom endogent mærkede kældermembranproteiner anbefales, er brugen af antistoffer mod specifikke BM-proteiner også kompatibel med de beskrevne protokoller. Disse protokoller er især nyttige for forskere, der er interesserede i at studere intracellulær handel og udskillelsen af BM-proteiner i intakt epitelvæv ved hjælp af konfokal og superopløsningsbilleddannelse. Desuden gør evnen til at kombinere epitelvævsanalyse med de ekspansive værktøjer i Drosophila genetik denne tilgang særlig kraftfuld. Endelig kunne disse protokoller let tilpasses til at studere vesikulær handel og sortering af andre proteiner af interesse.

Protocol

1. Flyv forberedelse til æggestokkens dissektioner Sæt 10-15 Drosophila melanogaster hunfluer (1-2 dage gamle) af den ønskede genotype i et smalt hætteglas indeholdende ~ 8 ml Drosophila fluesmedium drysset med en lille mængde granuleret bagergær 2-3 dage før dissektion ved 25 ° C. Tilføjelse af et par hanner til hætteglasset kan øge ægkammerets udbytte. Sørg dog for, at det samlede antal fluer ikke overstiger 20, da dette kan påvirke æggestokkenes udvikling ne…

Representative Results

De metoder, der er beskrevet heri, kan bruges til effektivt og præcist at afbilde og karakterisere den intracellulære handel og sekretion af BM-proteiner i polariserede epitelceller, såsom FE i Drosophila-æggestokken . Dernæst giver vi forventede resultater opnået ved hjælp af de beskrevne metoder samt nyttige råd og potentielle faldgruber. For at gøre dette anvendes Vkg-GFP, en endogent mærket Vkg (Drosophila Col IV). Imidlertid kan de samme resultater opnås med andre endogent mærkede BM-pr…

Discussion

BM er kritisk for embryonal og organmorfogenese og voksne fysiologiske funktioner. Desuden fungerer BM som en signalplatform til etablering og vedligeholdelse af epitelpolaritet og giver væv støtte². Alligevel er de mekanismer, der regulerer den korrekte placering af BM-proteiner, dårligt forstået. En bedre forståelse af de biologiske veje dedikeret til intracellulær handel og polariseret sekretion af BM-proteiner kræver en omhyggelig analyse af komponenterne i disse veje og deres roller i …

Materials

Alexa Fluor 546 phalloidin	Invitrogen	A22283	F-Actin Stain (1/500 of 66µM)
Alexa Fluor 647 phalloidin	Invitrogen	A22287	F-Actin Stain (1/100 of 66µM))
Anti-GM130 Antibody	abcam	ab30637	For Golgi Stain (colocalization); use as concentration of 7µg/uL
Aqua-Polymount	Polysciences, Inc.	1860620	Mounting Medium
Bakers Yeast (Active Dry Yeast)	Genesee Scientific	62-103	To fatten the overies for dissection
Bovine Serum Albumin (30% solution)	Sigma-Aldrich	A7284	For blocking solution
Depression wells	Electron Microscopy Sciences	7156101	For dissection (glass concavity slide can be used instead)
Dissecting needle	Fisher scientifc	13-820-024
Drosophila Incubator	Genesee Scientific/Invictus
Fly Stock: Perlecan-GFP Drosophila line (ZCL1700)			Morin et al., 2001
Fly Stock: UAS-Crag RNAi line (TRIP line HMS00241)	Bloomington Drosophila Stock Center	33594	RNAi against Crag
Fly Stock: Viking-GFP Drosophila line (CC00791)			Buszczak et al., 2007
Fly Stock: Vkg-GFP, tj-Gal4			Devergne et al., 2017. Drive the expression of Crag RNAi in the FE
Forceps (Dumont 5)	Fine Science Tools	11251-30	For dissection
Glass Concavity Slide	Electron Microscopy Sciences	7187804	For dissection (depression wells can be used instead)
Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11036	Secondary antibody (GM130 antibody) (5 µg/mL)
Hoechst (Hoechst 33342)	Invitrogen	H3570	DNA Stain (1 ug/mL)
Kimwipes	Kimtech	Fisher Scientific: 06-666	Delicate task wipers
Leica Fluorescent Stereo Microscope  M165 FC	Leica		For ovary imaging
Microscope Slides	Corning	294875X25	Microscope Slides
Nutating platform rocker	Corning Life Sciences	6720	For ovary fixation and staining
Nutri-Fly BF	Genesee Scientific	66-121	Fly Food
Paraformaldehyde 20% Solution	Electron Microscopy Sciences	Fisher Scientific: 15713	For PFA 4%
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher scientific	BP2944100	For PBS solution
ProLong Glass Antifade Mountant	Invitrogen	P36980	Mounting Medium
Square Cover Glass	Corning	285022	Cover glass for microscope slides
Triton x-100	Sigma-Aldrich	9036-19-5	For PBST
Zeiss LSM 900 with Airyscan 2	Zeiss		Confocal and super-resolution Microscope
Zeiss Stemi 305 Stereo Microscope	Zeiss		Dissecting microscope
Zeiss Zen Software version 3.3 (Blue Edition)	Zeiss		Image acquisition and processing