JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunologia e infezioni

הקרנה מרובת תפוקה גבוהה לסוכרת מסוג 1, מחלות צליאק ו-COVID-19

Published: July 05, 2022
doi:
10.3791/63787
, , , , ,
1Barbara Davis Center for Diabetes,University of Colorado School of Medicine, 2Department of Endocrinology, Guangzhou First People’s Hospital, School of Medicine,South China University of Technology

Summary

בהתאם לצורך הדחוף בבדיקות סקר לסוכרת מסוג 1, צליאק ומחלת קורונה 2019, פיתחנו בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה בתפוקה גבוהה של 6-Plex כדי לזהות בו זמנית את כל ארבעת הנוגדנים העצמיים של האיונים, נוגדנים עצמיים של רקמות טרנסגלוטמינאז, ונוגדנים לתחום קשירת הקולטן של תסמונת נשימתית חריפה חמורה נגיף קורונה 2.

Abstract

ניסוי קליני מתמשך, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), הוא מחקר הסינון הראשון באוכלוסייה הכללית לסוכרת מסוג 1 (T1D) וצליאק בארצות הברית. עם מגיפת מחלת נגיף הקורונה 2019 (COVID-19), האפידמיולוגיה של COVID-19 באוכלוסייה הכללית והידע על הקשר בין זיהום COVID-19 להתפתחות T1D נחוצים בדחיפות. שיטת הסינון הסטנדרטית כיום של הבדיקה המחייבת רדיו (RBA) עמדה בשני אתגרים גדולים: יעילות נמוכה בפורמט בדיקה יחיד וספציפיות מחלה נמוכה עם שיעור גדול של נוגדנים בעלי זיקה נמוכה הנוצרים בהקרנה. עם הפלטפורמה של בדיקת אלקטרוכמילומינסנציה מרובת המולטיפלקס (ECL) שהקמנו בעבר, פותחה בדיקה חדשנית של 6-Plex ECL המשלבת, בבאר אחת, את כל ארבעת הנוגדנים העצמיים של האיים (IAbs) לאינסולין, חומצה גלוטמית דקרבוקסילאז (GAD65), אנטיגן אינסולינומה 2 (IA-2), ואבץ טרנספורטר 8 (ZnT8) עבור T1D, נוגדנים עצמיים טרנסגלוטנאז (TGA) למחלת צליאק, ותסמונת נשימתית חריפה חמורה נוגדנים לנגיף הקורונה 2 (SARS-CoV-2) תחום קושר קולטן (RBD) עבור covid-19. הבדיקה אומתה בעיוורון באמצעות 880 דגימות ממחקר ASK, כולל 325 דגימות חיוביות ו-555 דגימות שליליות לנוגדנים, והושוותה ל-RBAs הסטנדרטיים ולבדיקת ECL אחת. עם היתרונות של יעילות גבוהה, עלות נמוכה ונפח סרום נמוך, בדיקה זו התקבלה ככלי הסינון העיקרי למחקר ASK.

Introduction

מחקרים אפידמיולוגיים גדולים ברחבי העולם מראים כי שכיחות סוכרת מסוג 1 (T1D) עלתה במהירות ב-3%-5% בשנה, ושכיחות ה-T1D הוכפלה ב-20 השנים האחרונות, במיוחד בקרב ילדים צעירים 1,2. נוגדנים עצמיים של איים (IAbs) מופיעים בדרך כלל שנים לפני הסימפטומים הקליניים והם כיום הסמנים הביולוגיים המנבאים והאבחנתיים האמינים ביותר עבור T1D3. סינון לנוגדנים עצמיים מסוג T1D יכול לזהות אנשים בסיכון להתקדמות ל-T1D קליני, לחנך את הציבור, להפחית במידה רבה את הסיבוך מסכן החיים של קטואצידוזיס, ולהועיל לניסויים קליניים לטיפולים מניעתיים. מאמצי מניעה עולמיים של T1D נמצאים בעיצומם, וניסויים התערבותיים מרובים מתבצעים בקרב נבדקים עם IAbs חיובי כדי לעכב את ההתקדמות ל- T1D קליני, ומרכז ברברה דייוויס לסוכרת השיק את הניסוי הקליני הראשון בארה”ב של הקרנה באוכלוסייה הכללית בשנת 2016 עבור T1D ומחלת צליאק, הקרנה אוטואימונית לילדים (ASK)4 . מחלת צליאק (CD) היא מחלה דלקתית כרונית במעיים הקשורה לגורמים חיסוניים וגנטיים. השכיחות של תקליטור בילדים עם T1D יכולה להגיע עד 24.5% 5. ייתכן שיותר ממחצית מהאנשים עם CD אינם סובלים מתסמינים אופייניים במצגת6, ולכן יש צורך בבדיקה סרולוגית לצליאק.

מאז החלה מגפת מחלת הקורונה 2019 (COVID-19), דווחו מעל 200 מיליון מקרים ברחבי העולם, וילדים מהווים עד 16% מהמקרים שאושרו במעבדה7. מחקרים רבים הוכיחו את ההשפעה של T1D קיים על חומרת ותמותה של זיהום COVID-198, בעוד ההשפעה של זיהום COVID-19 על התפתחות T1D אינה ברורה. חקירת השיעור הכולל של זיהום COVID-19 באוכלוסייה הכללית על ידי קביעת נוגדנים חמורים לנגיף הקורונה 2 (SARS-COV-2) וחקר הקשר בין זיהום ב- COVID-19 לבין הפעלת אוטואימוניות T1D או האצת התקדמות T1D נחוצים בדחיפות וחשובים מאוד, בעוד שמחקר ASK המתמשך הוא פלטפורמה מצוינת לכך. בשל פורמט הבדיקה הבודדת ויצירת חלק גדול מחיוביות הנוגדנים בעלי זיקה נמוכה, הבדיקה הסטנדרטית המחייבת רדיו (RBA) פגשה צוואר בקבוק של יעילות נמוכה וספציפיות נמוכה למחלה9. במאמר הנוכחי, אנו מציגים בדיקה חדשנית של אלקטרוכמילומינסנציה (ECL) בעלת 6 פלקסים הבנויה על פלטפורמת בדיקת המולטיפלקס הקודמת שלנו ECL באמצעות צלחת מרובת פלקס, המשלבת שישה מבחני נוגדנים עצמיים בבאר אחת, כולל כל ארבעת ה- IAbs העיקריים לאינסולין (IAA), חומצה גלוטמית דקרבוקסילאז-65 (GADA), אנטיגן אינסולינומה -2 (IA-2A) והובלת אבץ-8 (ZnT8A), נוגדנים עצמיים לטרנסגלוטמינאז (TGA) למחלת צליאק, ונוגדנים בתחום קושרי הקולטן של SARS-CoV-2 (RBD) (COVID-19A). זוהי בדיקת המולטיפלקס הראשונה שגייסה פאנל שלם של ארבעה IAbs עיקריים ושילבה זאת עם TGA ו- COVID-19A. הוא אומת והתקבל רשמית ככלי הסינון העיקרי המחליף את ה- RBA הסטנדרטי במחקר ASK.

Protocol

פרוטוקול המחקר אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית המרובים של קולורדו. 1. הכנת חיץ הכן את מאגר הסימון (2x PBS, pH 7.9): הוסף 100 מ”ל של 10x PBS ל-400 מ”ל של מים מזוקקים וכוונן את ה-pH באמצעות NaOH ל-7.9. הכינו 3 מ”מ של ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS: המיסו 1 מ”ג ביוטין ב-588 מיקרו-ליטר של חיץ תיוג והמיסו 150 ננומול של Ru Sulfo-NHS ב-50 μL של חיץ התוויה. הכן את מאגר האנטיגן (1% BSA): המיס 5 גרם של אלבומין בסרום בקר (BSA) ב-500 מ”ל של PBS אחד. הכן את מאגר הציפוי (3% חוסם A): המסה של 15 גרם חוסם A ב-500 מ”ל של PBS אחד. הכינו את חיץ הכביסה הראשון (0.05% Tween 20, PBST): ערבבו 2.5 מ”ל של Tween 20 ב-5,000 מ”ל של PBS אחד. הכינו את חיץ הכביסה השני (0.4 מ’ NaCl): ערבבו 50 מ”ל של 5 מ”ל NaCl ב-575 מ”ל מים מזוקקים כדי ליצור את תמיסת NaCl של 0.4 מ’.הערה: לתיוג יעיל, השתמש תמיד בתמיסות ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS טריות ולא בתמיסות מאוחסנות שיוצרו בעבר. 2. תיוג חלבון אנטיגן עם ביוטין ו- Ru Sulfo-NHS בנפרד הערה: ריכוז גבוה יותר של חלבון אנטיגן ≥0.5 מ”ג/מ”ל מומלץ ליעילות תיוג גבוהה יותר. הכן שש תמיסות חלבון אנטיגן ממוקדות, כולל פרואינסולין, GAD-65, IA-2, ZnT8, TG ותחום קשירת קולטנים (RBD) של חלבון הספייק של SARS-CoV-2. חשב את השומות של כל חלבון אנטיגן על פי המשקל המולקולרי שלו ובצע יחסים טוחנות מתאימים של ביוטין או Ru Sulfo-NHS. היחס בין אנטיגן לסכום הביוטין או Ru Sulfo-NHS יהיה 1:5 עבור אנטיגנים מולקולריים קטנים (משקל מולקולרי ≤10 kd), כגון חלבון פרואינסולין. עבור אנטיגנים מולקולריים בינוניים (משקל מולקולרי 10-50 kd), כגון ZnT8, היחס יתאים את עצמו ל-1:10. עבור אנטיגנים בעלי משקל מולקולרי גדול (משקל מולקולרי >50 kd), כגון GAD, יחס הטוחנות יהיה 1:20. חלקו את חלבון האנטיגן לשני חלקים שווים וערבבו אותו בנפרד עם ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS באמצעות יחס טוחנות מחושב בשלב 2.1. דגרו את התערובת בטמפרטורת החדר (RT) למשך שעה וחצי, תוך הימנעות מאור.הערה: יש להסיר את כל הכימיקלים המפחיתים כגון טריס או גליצין במאגר של חלבון אנטיגן על ידי עמודת ספין בגודל עם חיץ של 2x PBS (pH 7.9). הגדילו את עמודות הספין עם 2x PBS (גודל עמודת הספין, 2 מ”ל או 5 מ”ל, תלוי בנפח חלבון האנטיגן המתויג): הוסיפו 1 מ”ל של מאגר PBS 2x לעמודת הספין, עשו צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות, וחזרו על השלב פי 2 יותר. תנו לתערובת חלבון האנטיגן-ביוטין או -Ru Sulfo-NHS לעבור דרך עמודת הספין הראשונית 1x (צנטריפוגה של העמודה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות) כדי לטהר ולעצור את תגובת התיוג. מדוד את הנפח הסופי של חלבון האנטיגן המסומן המסומן מעמודות הספין, תוך חישוב הריכוזים של חלבון אנטיגן המסומן בביוטין או Ru Sulfo-NHS. הכינו אליקוטים קטנים יותר של חלבון אנטיגן מסומן (50 μL/tube) ואחסנו אותם בטמפרטורה של 80°C- לשימוש ארוך טווח.הערה: הכיסוי של חלבון לאחר כל עמודת ספין יהיה כ-90%-95% אחוזי שמירה. 3. הגדר את הריכוז והיחסים הטובים ביותר עבור אנטיגנים המסומנים בביוטין וברו סולפו-NHS עבור בדיקת ECL 6-Plex (בדיקת לוח משבצות) הערה: בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן נחוצה לפני שילוב בבדיקה המורכבת. החל את בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן בנפרד.הערה: שלבים 3.2.-3.7. ישתמש ב- TGA כדוגמה קצרה. תהליך הבדיקה של לוח המשבצות של TGA נועד לדמות את תהליך הבדיקה אך עם סוג אחד בלבד של אנטיגן. בצע את הדילול הסדרתי של tTG שעבר ביוטינילציה ו- Ru Sulfo-NHS שכותרתו tTG. ריכוזי העבודה המומלצים של תמיסת התערובת הראשונה מתחילים מ-240 ננוגרם/מ”ל הן עבור tTG שעבר ביוטינילציה והן עבור tTG עם תווית Ru Sulfo-NHS. נניח שהריכוזים של tTG המקורי וה-Ru Sulfo-NHS הם 1.0 מיקרוגרם/μL. בצע דילול של פי 10 של ה-tTG המקורי עם התווית Ru Sulfo-NHS ודילול של פי 5 של ה-tTG המקורי עם 5% BSA. יש לערבב 4 μL של חלבון tTG שעבר ביוטינילציה עם 156 μL של 5% BSA (חיץ אנטיגן) ו-240 μL של המקשר המצומד לסטרפטווידין בצינור אחד ולדגור את התמיסה ב-RT למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 160 μL של תמיסת עצירה, ודגירה ב- RT למשך 30 דקות נוספות. קח 400 μL של התערובת ומערבבים עם 2 מ”ל של תמיסת עצירה. הריכוז של tTG שעבר ביוטינילציה בתערובת הוא 240 ננוגרם/מ”ל. כדי לבצע דילול סדרתי לאנטיגן ZnT8 עם תווית ביוטין, הכינו עוד חמש שפופרות חדשות, קחו 1 מ”ל של אליקוט מהתערובת בשלב 3.3. ומערבבים עם 1 מ”ל של תמיסת עצירה בצינור חדש, ומקבלים את התערובת בריכוז של 120 ננוגרם/מ”ל. חזור על שלב זה, בצע דילולים סדרתיים של 1:1, וקבל את ה-tTG עם תווית הביוטין ב-60 ננוגרם/מ”ל, 30 ננוגרם/מ”ל, 15 ננוגרם/מ”ל ו-7.5 ננוגרם/מ”ל. הוסף 4 μL של Ru Sulfo-NHS עם תווית tTG עם 1.6 מ”ל של תמיסת עצירה, וקבל תערובת של Ru Sulfo-NHS עם תווית tTG בריכוז של 240 ננוגרם/מ”ל. עם אותם שלבים של 3.4., בצע דילולים סדרתיים של 1:1 וקבל את האנטיגן ZnT8 המסומן ב- Ru Sulfo-NHS ב- 60 ng/mL, 30 ng/mL, 15 ng/mL, 7.5 ng/mL ו-3.75 ng/mL. הריכוז האחרון הוא 0 ng/mL, עם תמיסת עצירה בלבד וללא אנטיגן עם תווית Ru Sulfo-NHS. הכן דגימות סרום בקרה חיובית ובקרה שלילית של tTG (מאושרות מראש ומתוקננות על ידי בדיקת ECL tTG יחידה) וצלחת PCR של 96 בארות. Aliquot את דגימות סרום הבקרה החיוביות והשליליות למחצית השמאלית והימנית של הצלחת, בהתאמה, עם 7 μL בכל באר. הוסיפו 1x PBS לצלחת, עם 33 μL לכל באר. במחצית השמאלית של לוחית ה-PCR, הוסיפו 24 μL של תמיסת tTG-linker טורית מדוללת עם תווית ביוטין לכל באר, עמודה אחת עם ריכוז אחד בסדר של הגבוה ביותר לנמוך ביותר. באותו אופן, להוסיף 16 μL של סדרתי מדולל Ru Sulfo-NHS שכותרתו אנטיגן tTG לכל באר, שורה אחת עם ריכוז אחד, ולאחר מכן לערבב היטב. חזור על השלב על החצי הימני של צלחת ה- PCR. המשך את שאר שלבי הבדיקה המתוארים בשלבים 5.3.-9.1. עד לקבלת נתוני הספירה הגולמיים. חשב את היחסים בין אותות בקרה חיוביים לאותות בקרה שליליים תואמים. קבע את הריכוז הטוב ביותר עבור האנטיגן המסומן בביוטין והאנטיגן המסומן Ru Sulfo-NHS עם ערכי יחס גבוהים יותר ורקע נמוך יותר עבור דגימת הבקרה השלילית. ריכוזי העבודה האופטימליים של ביוטין ו-Ru Sulfo-NHS המסומנים כחלבון אנטיגן מוצגים להלן: 16.0 נ”ג/מ”ל ו-8.0 נ”ג/מ”ל עבור GAD65, 18.8 נ”ג/מ”ל ו-9.4 נ”ג/מ”ל עבור SARS-CoV-2 RBD, 42.0 נ”ג/מ”ל ו-42.0 נ”ג/מ”ל עבור IA-2, 60.0 נ”ג/מ”ל ו-60.0 נ”ג/מ”ל עבור tTG, 4.2 נ”ג/מ”ל ו-4.2 נ”ג/מ”ל עבור ZnT8, ו-31.3 נ”ג/מ”ל ו-31.3 נ”ג/מ”ל לפרוזולין. 4. צור פתרון אנטיגן מצומד מקשר דלל את האנטיגנים המסומנים בביוטין וב-Ru Sulfo-NHS עם 5% BSA לריכוזי העבודה האופטימליים בהתאם לשלב 3.9. קשירת מקשרים שנבחרו מראש לכל חלבון אנטיגן שעבר ביוטינילציה. עבור בדיקת צלחת אחת של 96 בארות, הוסף 4 μL של GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 וחלבון אנטיגן פרוינסולין לצינור נפרד המכיל 156 μL של 1% BSA וערבב עם 240 μL של המקשרים המצומדים המתאימים לסטרפטווידין 1, 2, 3, 8, 9 ו-10 (איור 1). לדגור את התערובת במשך 30 דקות ב- RT. Aliquot 160 μL של תמיסת עצירה בכל צינור ודגירה של התערובת ב- RT למשך 30 דקות. הוציאו 400 מיקרון של תמיסת התערובת מכל צינור ושלבו אותם יחד. הוסף 4 μL של Ru Sulfo-NHS שכותרתו GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 ואנטיגן פרואינסולין לתערובת לעיל, ולאחר מכן הוסף 1.6 מ”ל של תמיסת עצירה ו-3.2 מ”ל של PBS ותערובת אחת. עכשיו פתרון האנטיגן מוכן לשימוש בבדיקה. 5. דגירה דגימות סרום עם האנטיגן המסומן Aliquot 7 μL של סרום לכל באר עבור צלחת PCR 96 באר לכסות עם סרט איטום. מחממים את הסרה בטמפרטורה של 56 מעלות למשך 30 דקות במכונת PCR. צנטריפוגה קצרה את הצלחת ב 100 x גרם במשך 1 דקה. מוסיפים 63 μL של תמיסת אנטיגן (מוכנה בשלב 4.4) לכל באר, ומערבבים עם הסרה. כסו את לוחית ה-PCR בנייר כסף לאיטום כדי למנוע אור. נערו את הצלחת על שייקר ב-450 סל”ד ב-RT למשך שעתיים ולאחר מכן דגרו את הצלחת ב-4 מעלות צלזיוס למשך 18-24 שעות. 6. מכינים את צלחת ה-6 פלקס קח צלחת 6-Plex מהמקרר 4 מעלות צלזיוס, ואפשר לצלחת להגיע ל- RT. הוסף 150 מיקרוגרם של 3% חוסם A לכל באר של צלחת 6-Plex. מחזירים את הצלחת למקרר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מכסים את הצלחת בנייר כסף ונמנעים מאור, ודוגרים למשך הלילה.הערה: שלבי הבדיקה ביום 1 כוללים את סעיפים 4.-6. 7. מעבירים דגירה של סרום/אנטיגן לצלחת 6-Plex למחרת, הוציאו את צלחת ה-6-Plex מהמקרר וזרקו את כל החיץ מהצלחת. טפחו את הצלחת על מגבות נייר לייבוש. שטפו את צלחת ה-6 Plex 3x עם 150 מיקרון ליטר של חיץ כביסה בכל באר בכל פעם. מייבשים את הצלחת על מגבות נייר, וסרום/אנטיגן aliquot דוגר מכל באר של צלחת ה-PCR הדוגרה למשך הלילה לשתי בארות של צלחת 6-Plex (30 מיקרו-ליטר לבאר לכפילויות). מכסים את הצלחת בנייר כסף, ואז מניחים את הצלחת על שייקר צלחת, ומנערים במהירות של 450 סל”ד ב-RT למשך שעה אחת. 8. שוטפים את צלחת ה-6 Plex ומוסיפים את מאגר הקריאה השליכו את התמיסה לצלחת 6-Plex ושטפו את הצלחת פי 3 עם 150 מיקרון ליטר של 0.4 M NaCl חיץ כביסה לכל באר בכל פעם. לאחר השלמת הכביסה השלישית, ייבשו את הצלחת כנגד מגבת הנייר והוסיפו 150 מיקרוגרם קריאה לכל באר.הערה: בועות אוויר בבאר משפיעות על הדיוק של מכונת קורא הצלחות ויש להימנע מהן בכל מחיר. 9. קרא את הצלחת ונתח את הנתונים לספור את הצלחת על מנתח electrochemiluminescence. תוצאות הקריאה יוצגו עם הערכים בספירות לשנייה (CPS). חשב את מדד הנוגדנים היחסי של כל דגימה באמצעות ה- CPS הגולמי המתקבל ממכונת הקריאה כנגד ה- CPS של הבקרות החיוביות והשליליות הסטנדרטיות הפנימיות של כל נוגדן ספציפי (ערך אינדקס = [CPS (מדגם) – CPS (תקן שלילי)] / [CPS (תקן חיובי) – CPS (תקן שלילי)]). קבע תוצאות נוגדנים שליליות או חיוביות באמצעות ערכי החיתוך שנקבעובאחוזונים 99.5עד 99.8 של 555 דגימות בקרה שליליות ממחקר ASK (כל הנוגדנים דגימות שליליות ללא היסטוריה או היסטוריה משפחתית של סוכרת או כל סוג אחר של מחלה אוטואימונית).הערה: שלבי הבדיקה ביום 2 כוללים את סעיפים 7-9.

Representative Results

טבלה 1, טבלה 2 וטבלה 3 ממחישות את התוצאות המייצגות. ה- CPS הגולמיים המתקבלים ממכונת הקריאה מתוארים בטבלה 1. בטבלה 2, CPS גולמיים סודרו ומוינו על ידי ששת המקשרים והנוגדנים המתאימים. טבלה 3 מציגה את ערכי האינדקס המחושבים עם CPS כמתואר בפרוטוקול הבדיקה. יש לבדוק את כל ערכי הספירה הגולמית כדי למנוע תוצאות אינדקס סופיות שגויות הנגרמות על-ידי כפילויות שגויות. בטבלה 1 ניתנות דוגמאות לכפילויות שגויות, שהביאו לשגיאה בחישוב המדד הסופי בטבלה 3. בדיקה זו אומתה באופן עיוור באמצעות 880 דגימות נבחרות ממחקר ASK עם 325 דגימות חיוביות של IAbs ו-555 דגימות שליליות של Abs. הרמות של נוגדנים עצמיים מבדיקת ECL של 6-Plex עבור 880 הדגימות הושוו נקודה אחר נקודה עם הרמות של מבחני ECL בודדים מקבילים (איור 2) ועם RBA סטנדרטי יחיד תואם (איור 3). הניתוק, הרגישות והספציפיות של כל נוגדן מפורטים בטבלה 4. הרגישות והספציפיות של מבחן ECL-COVID-19A זה זוהו כ-100% ו-99.9%,בהתאמה 10. איור 1: איור של מבחן ECL 6-Plex. נוגדנים עצמיים בסרום יוצרים את החיבור של האנטיגן המסומן Ru Sulfo-NHS לאנטיגן הביוטינילציה, אשר יחד עם מקשר ספציפי ויוצר קומפלקס של אנטיגן-נוגדן-אנטיגן-מקשר. הקומפלקסים נלכדים דרך כל מקשר ספציפי אל הנקודות הספציפיות בלוח 6-Plex. עבור כל אנטיגן, מספרי המקשר הספציפיים הוקצו: GAD-linker-1, Covid-19-linker-2, IA-2-linker-3, tTG-linker-8, ZnT8-linker-9, ו- Proinslulin-linker-10. נתון זה שונה באישורם של He et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: השוואה של שש רמות נוגדנים ב-880 דגימות ממחקר ASK בין בדיקת ECL יחידה לבדיקת ECL 6-Plex. הפאנלים מציגים השוואות של רמות נוגדנים עבור GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA ו- COVID-19A, בהתאמה (מדד COVID-19A הוצג כ- (100 x ערך מדד מחושב)). הקווים המקווקווים מייצגים את ניתוקי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים. נתון זה שונה באישורם של He et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: השוואה של חמש רמות נוגדנים ב-880 דגימות ממחקר ASK בין ה-RBA לבדיקת ECL 6-Plex. הפאנלים מציגים השוואות של רמות נוגדנים עבור GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A ו- TGA, בהתאמה. הקווים המקווקווים מייצגים את ניתוקי הבדיקה עבור כל בדיקת נוגדנים. נתון זה שונה באישורם של He et al.11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. טבלה 1: ספירת CPS גולמית (המחצית השמאלית של הצלחת). ספירות CPS גולמיות שנרכשו מהמחצית השמאלית של צלחת בדיקה. כל דגימה מתבצעת בכפילות. כל ספירת CPS באותה עמודה (A1, A2, A3 וכו’) מייצגת את נתוני הקריאה מ-10 הנקודות באותה באר (מספרי המקשר המתאימים מסומנים). דוגמאות לכפילויות פגומות מודגשות באפור, כפי שניתן לראות בשורה D-linker 3 עמודה 5 ועמודה 6. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 2: סידור נתוני טבלה 1, ממוינים באמצעות שישה מקשרים. ערכי CPS מטבלה 1 סודרו מחדש, תוך חישוב הערכים הממוצעים לקריאות כפולות של CPS ומחיקת ערכים שאינם בשימוש עבור מקשרים 4-7. הערכים של הבקרות החיוביות הפנימיות, החיוביות הנמוכות והשליליות של כל בדיקה של נוגדנים עצמיים מסומנים בהדגשה כהה. מחשב, שליטה חיובית. NC, שליטה שלילית. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 3: תוצאות של ערכי אינדקס. ערכי המדד עבור כל דגימה עבור כל ששת הנוגדנים חושבו כנגד הבקרות החיוביות והשליליות המתאימות. ערך אינדקס גדול מערך החיתוך הוגדר כחיובי, מסומן בהדגשה כהה. ערכי ה-CPS הכפולים הרעים בטבלה 1, שורה D-linker 3-עמודות 5 ו-6, הובילו לערך אינדקס IA-2A חיובי של מדגם 11 (מסומן באפור), שהיה ככל הנראה תוצאה חיובית שגויה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו. טבלה 4: בדיקת ניתוק, רגישות וספציפיות עבור GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA ו-TGA בקרב 880 דגימות ASK, כולל 325 דגימות חיוביות של IAbs ו-555 דגימות שליליות של נוגדנים. ערך מדד הניתוק האופטימלי של GADA, IA-2A, ZnT8A, IAA ובדיקת TGA נקבע לפחות לאחוזון ה-99 מתוך 555 דגימות הבקרה הרגילות. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

Discussion

ההתערבות עבור T1D נכנסה לעידן שלפני T1D, עם תוכניות סינון ארציות ובינלאומיות מתמשכות בקנה מידה גדול עבור T1D וניסויים קליניים פורחים המיושמים בשלב 1 T1D כדי לבטל או להאט את ההתקדמות ל- T1D12,13 קליני. מדידות של ארבעה IAbs באמצעות RBA הסטנדרטי הנוכחי עם פורמט בדיקת IAb יחיד הן מייגעות ולא יעילות עבור תוכנית סינון המונית. עם הדרישה הדחופה לבדיקת IAbs מרובת תפוקה גבוהה, בדיקת ECL מרובבת, ICA ELISA בעל 3 מסכים וזיהוי נוגדנים על ידי אגלוטינציה-PCR (ADAP) התגלו כטכנולוגיות תחרותיות כיום. במחקר Fr1da של סינון T1D באוכלוסייה של ילדים צעירים בגרמניה, ICA ELISA בעל 3 מסכים המשלב 3 IAbs (GADA, IA-2A ו- ZnT8A) שימש כמבחן העיקרי14. מגבלה מרכזית של ICA ELISA בעל 3 מסכים היא היעדר IAA, שהוא בעיקר ה-IAb הראשון שמופיע עם שכיחות גבוהה בילדים צעירים עם T1D. יתר על כן, הבדיקה אינה מסוגלת להבחין איזה מבין שלושת ה- IAbs הוא חיובי לבין אות חיובי, ויש לחזור על כל דגימה חיובית עם שלושה מבחנים בודדים לאישור. ADAP15 משלב GADA, IA-2A ו-IAA וממחיש רגישות וספציפיות גבוהה לבדיקות בסדנת ה-IASP, אך חסרים בו נתונים לגבי מידת הניבוי שלו בסינון מבוסס אוכלוסייה למחקרי T1D, שסדנת ה-IASP אינה מסוגלת לקבוע. בדיקת המולטיפלקס ECL במחקר הנוכחי בנויה על הפלטפורמה של בדיקת ECL יחידה שאומתה מול RBA סטנדרטי נוכחי במספר ניסויים קליניים כמו TrailNet9,16, DAISY17,18,19 ו- ASK 4,20,21 מחקר. הבדיקה הנוכחית אומתה הן כנגד בדיקת RBA והן כנגד בדיקת ECL יחידה באמצעות 880 דגימות סרום ממשתתפי מחקר ASK. כפי שניתן לראות באיור 2 ובאיור 3, רמות הנוגדנים בין 6-Plex ל-ECL יחיד או בין 6-Plex ל-RBA היו תואמות ברובן זו את זו לחיוביות של נוגדנים. שיעורי צירוף המקרים של IAbs שנבדקו על ידי RBA ו- 6-Plex היו 91.7%-97.8%, ושיעורי צירוף המקרים של IAbs שנבדקו על ידי ECL יחיד ו- 6-Plex היו 95.3%-99.2%. המחלוקת בין מבחן ECL ל-RBA הייתה בעיקר מאלו עם IAb יחיד. רמות ה-IAbs שנבדקו על-ידי 6-Plex ו-ECL יחיד (r = 0.6431-0.9434, כולן p < 0.0001) ו-6-Plex ו-RBA (r = 0.5775-0.8576, כל p < 0.0001) היו מתואמות היטב גם כן. TGA שנבדקו על ידי מבחן 6-Plex היו מתואמים מאוד עם התוצאות של בדיקת RBA (99.4%) ובדיקת ECL יחידה (99.4%). בנוסף, COVID-19A שנבדק על ידי 6-Plex הגיע לתאימות של 99.8% לתוצאות בדיקת ECL יחידה.

כתוצאה מכך, בדיקת 6-Plex ECL התקבלה רשמית כשיטת הסינון העיקרית למחקר ASK המתמשך והחליפה את תקן RBA22. בדיקה זו הדגימה את הרגישות והספציפיות המצוינות שלו עם תפוקה גבוהה יותר, עלות נמוכה יותר ונפח קטן יותר של סרום בהשוואה ל- RBA סטנדרטי.

תועד כי במחקר סינון T1D, IAb יחיד שזוהה על ידי RBA, אשר תפס חלק גדול מהחיוביות של IAb, היה בעל זיקה נמוכה, עם סיכון נמוך למחלות, והביא לערך ניבוי נמוך כולל 19,21,23,24,25,26. חיזוי סיכון נמוך כזה גרם לעלויות נוספות עצומות של ביקורי מעקב והביא לקשיים במחקרי מניעה של T1D. פלטפורמת בדיקת ה- ECL המבוססת הוכחה בניסויים קליניים מרובים כמפלה IAbs בעלי זיקה גבוהה מ- IAbs בעלי זיקה נמוכה שנוצרו על ידי RBA ומשפרים באופן משמעותי את ערכי הניבוי עבור כל ארבעת ה- IAbs, במיוחד עם חיוביות IAbיחידה 16,17,18,21 . טכנולוגיית בדיקת המולטיפלקס ECL נבנתה על הפלטפורמה של בדיקת ECL יחידה, עם יתרון מובהק זה של זיהוי ABS בעל זיקה גבוהה. במחקר הנוכחי, מבחן ECL 6-Plex המחיש את הדמיון שלו למבחני ECL הבודדים המקבילים ברגישות ובספציפיות.

מגבלות מסוימות והחששות הטכניים של בדיקת ECL המולטיפלקס באמצעות לוחות Plex מרובים כבר כוסו בפרסומים קודמים27,28. עם שישה אנטיגנים מסומנים בבאר אחת, עשויות להיות השפעות מסוימות בין אנטיגנים שונים, ורקע הבדיקה עשוי לגדול כאשר מוסיפים כל בדיקת נוגדנים לריבוי באותה באר. נדרשת כמות גדולה של עבודת אופטימיזציה של הבדיקה כדי להתאים את תנאי הבדיקה, במיוחד להתאמת הריכוזים הסופיים של כל חלבון אנטיגן מסומן בהתבסס על בדיקת לוח המשבצות עבור כל אנטיגן, כדי לשמור על הרגישות והספציפיות עבור כל בדיקת נוגדנים. כפי שצוין במחקרים קודמים27,28, מספר קטן של דגימות (<1%) גורמות לחיוביות שגויה על צלחת Plex מרובה ללא סיבה בסיסית ברורה. יש לחזור על כל התוצאות החיוביות ולאשר אותן על ידי בדיקת ECL אחת כהבטחת איכות מעבדה שגרתית; בדרך כלל, התוצאות החיוביות המוטעות יוסרו. תוצאות שליליות כוזבות שנגרמו על ידי "אפקט פרוזון" שנצפו במבחן ECL 7-Plex הקודם27,28 לא נצפו במחקר הנוכחי. בבדיקה המתוארת כאן, הסרנו את שלב הטיפול בחומצי בדגימות סרום מהפרוטוקול הקודם; במקום זאת, חיממנו מראש את דגימות הסרום בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות (שלב 5.1.). ביום השני לשטיפת הצלחות, השתמשנו בחיץ כביסה המכיל 0.4 M NaCl (שלב 8.1.) במקום חיץ כביסה רגיל כדי לשטוף את הצלחת בצורה קפדנית יותר. שינויים אלה הפכו את בדיקת המולטיפלקס ECL לפשוטה יותר ורקע נמוך יותר מבלי לאבד את רגישות הבדיקה.

לסיכום, לבדיקה זו יש ביצועים יוצאי דופן לזיהוי ארבעה IAbs, TGA ו- COVID-19A בו זמנית. תכונת הריבוי, כמו גם התפוקה הגבוהה, העלות הנמוכה ודרישת נפח הסרום הקטן, הופכים את ההקרנה בקנה מידה גדול עבור T1D ומחלות במקביל להרבה יותר אפשרית באוכלוסייה הכללית. לחולים עם T1D או כל מחלה אוטואימונית יש סיכון גבוה בהרבה למחלות אוטואימוניות אחרות. בדיקת המולטיפלקס ECL מספקת פלטפורמה מצוינת לסינון T1D ומחלות אוטואימוניות מרובות בו זמנית.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר נתמך על ידי מענק JDRF 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, מענק NIH DK32083, ומענק מרכז המחקר לסוכרת (DRC) P30 DK116073.

Materials

5 mM NaCl ThermoFisher 1070832
96-well Plate Shaker VWR 12620-926
96-well round bottom plate Fisher 8408220
Biotin ThermoFisher PI21329
Blocker A MSD R93AA
Bottle-Top 500 ml-Filter Units Fisher 0974064A
Bovine Serum Albumin Sigma A-7906
GAD65 protein Diamyd Medical 10-65702-01
IA-2 protein (aa 605-979) Creative BioMart 283309
MESO QuickPlex SQ120 MSD R31QQ-3 Electrochemiluminescence analyzer
PBS 10x ThermoFisher 70011044
PBS 1x ThermoFisher 10010023
Proinsulin protein AmideBio 20160118B3
Read buffer B MSD Y0800019
SARS-CoV-2 RBD protein Creative Biomart Spike-190V
Stop Solution MSD Y0090019
Sulfo-TAG MSD R91AO-1
tTG protein Diarect AG 15201
Tween 20 Sigma P-1379
U-Plex 6-Assay SECTOR plate MSD Z00U0142E 6-plex plate
U-PLEX Linker 1 MSD L0010022
U-PLEX Linker 10 MSD L0100020
U-PLEX Linker 2 MSD L0020015
U-PLEX Linker 3 MSD L0030018
U-PLEX Linker 8 MSD L0080018
U-PLEX Linker 9 MSD L0090014
ZeBa Column ThermoFisher 89892 Spin columns
ZnT8 protein Research Laboratory n/a
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Group, T. S. The Environmental Determinants of Diabetes in the Young (TEDDY) Study. Annals of the New York Academy of Sciences. 1150, 1-13 (2008).
  2. Vehik, K., et al. Increasing incidence of type 1 diabetes in 0- to 17-year-old Colorado youth. Diabetes Care. 30 (3), 503-509 (2007).
  3. Insel, R. A., et al. Staging presymptomatic type 1 diabetes: a scientific statement of JDRF, the Endocrine Society, and the American Diabetes Association. Diabetes Care. 38 (10), 1964-1974 (2015).
  4. Stahl, M. G., et al. Mass screening for celiac disease: The autoimmunity screening for kids study. The American Journal of Gastroenterology. 116 (1), 180-187 (2021).
  5. Al-Hussaini, A., Sulaiman, N., Al-Zahrani, M., Alenizi, A., El Haj, I. High prevalence of celiac disease among Saudi children with type 1 diabetes: A prospective cross-sectional study. BMC Gastroenterology. 12, 180 (2012).
  6. Agardh, D., et al. Clinical features of celiac disease: A prospective birth cohort. Pediatrics. 135 (4), 627-634 (2015).
  7. COVID-19: Clinical manifestations and diagnosis in children. UpToDate Available from: https://www.uptodate.com/contents/covid-19-clinical-manifestations-and-diagnosis-in-children/print (2021)
  8. Barron, E., et al. Associations of type 1 and type 2 diabetes with COVID-19-related mortality in England: a whole-population study. The Lancet Diabetes & Endocrinology. 8 (10), 813-822 (2020).
  9. Miao, D., et al. Electrochemiluminescence assays for insulin and glutamic acid decarboxylase autoantibodies improve prediction of type 1 diabetes risk. Diabetes Technology & Therapeutics. 17 (2), 119-127 (2015).
  10. Jia, X., et al. Prevalence of SARS-CoV-2 antibodies in children and adults with Type 1 diabetes. Diabetes Technology & Therapeutics. 23 (7), 517-521 (2021).
  11. He, L., et al. High-throughput multiplex electrochemiluminescence assay applicable to general population screening for type 1 diabetes and celiac disease. Diabetes Technology & Therapeutics. , (2022).
  12. McQueen, R. B., et al. Cost and cost-effectiveness of large-scale screening for type 1 diabetes in Colorado. Diabetes Care. 43 (7), 1496-1503 (2020).
  13. Insel, R. A., Dunne, J. L., Ziegler, A. G. General population screening for type 1 diabetes: has its time come. Current Opinion in Endocrinology & Diabetes and Obesity. 22 (4), 270-276 (2015).
  14. Ziegler, A. G., et al. 3 Screen ELISA for high-throughput detection of beta cell autoantibodies in capillary blood. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (11), 687-693 (2016).
  15. Cortez, F. J., et al. Sensitive detection of multiple islet autoantibodies in type 1 diabetes using small sample volumes by agglutination-PCR. PLoS One. 15 (11), 0242049 (2020).
  16. Steck, A. K., et al. ECL-IAA and ECL-GADA can identify high-risk single autoantibody-positive relatives in the TrialNet pathway to prevention study. Diabetes Technology & Therapeutics. 18 (7), 410-414 (2016).
  17. Yu, L., et al. Proinsulin/Insulin autoantibodies measured with electrochemiluminescent assay are the earliest indicator of prediabetic islet autoimmunity. Diabetes Care. 36 (8), 2266-2270 (2013).
  18. Miao, D., et al. GAD65 autoantibodies detected by electrochemiluminescence assay identify high risk for type 1 diabetes. Diabetes. 62 (12), 4174-4178 (2013).
  19. Yu, L., et al. Distinguishing persistent insulin autoantibodies with differential risk: Nonradioactive bivalent proinsulin/insulin autoantibody assay. Diabetes. 61 (1), 179-186 (2012).
  20. Zhao, Z., et al. Higher sensitivity and earlier identification of celiac disease autoimmunity by a nonradioactive assay for transglutaminase autoantibodies. Journal of Immunology Research. 2016, 2904563 (2016).
  21. Jia, X., et al. High-affinity ZnT8 autoantibodies by electrochemiluminescence assay improve risk prediction for type 1 diabetes. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 106 (12), 3455-3463 (2021).
  22. He, L., et al. A complete-panel islet autoantibody multiplex ECL assay. Diabetes. 70, 158 (2021).
  23. Achenbach, P., et al. Mature high-affinity immune responses to (pro)insulin anticipate the autoimmune cascade that leads to type 1 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 114 (4), 589-597 (2004).
  24. Schlosser, M., et al. In insulin-autoantibody-positive children from the general population, antibody affinity identifies those at high and low risk. Diabetologia. 48 (9), 1830-1832 (2005).
  25. Mayr, A., et al. GAD autoantibody affinity and epitope specificity identify distinct immunization profiles in children at risk for type 1 diabetes. Diabetes. 56 (6), 1527-1533 (2007).
  26. Siljander, H., et al. Role of insulin autoantibody affinity as a predictive marker for type 1 diabetes in young children with HLA-conferred disease susceptibility. Diabetes/Metabolism Research and Reviews. 25 (7), 615-622 (2009).
  27. Gu, Y., et al. High-throughput multiplexed autoantibody detection to screen type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases simultaneously. Ebiomedicine. 47, 365-372 (2019).
  28. Jia, X., He, L., Gu, Y., High, H., Yu, L. A high-throughput electrochemiluminescence 7-plex assay simultaneously screening for type 1 diabetes and multiple autoimmune diseases. Journal of Visualized Experiments. (159), e61160 (2020).

Tags

Multiplex AssayAutoantibody ScreeningType 1 DiabetesCeliac DiseaseCOVID-19GAD65SARS-CoV-2 RBDIA-2TTGZnT8ProinsulinBiotinylated AntigenRuthenium-labeled AntigenHigh-throughput ScreeningEarly Disease PredictionPrecise Diagnosis
check_url/it/63787?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Jia, X., He, L., Miao, D., Zhang, C., Rewers, M., Yu, L. A High-Throughput Multiplexed Screening for Type 1 Diabetes, Celiac Diseases, and COVID-19. J. Vis. Exp. (185), e63787, doi:10.3791/63787 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image