I tråd med det presserende behov for screening for type 1-diabetes, cøliaki og coronavirus sygdom 2019 udviklede vi et 6-Plex elektrokemiluminescensassay med høj gennemstrømning for samtidig at detektere alle fire ø-autoantistoffer, vævstransglutaminaseautoantistoffer og antistoffer mod receptorbindingsdomænet for alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2.
Et igangværende klinisk forsøg, Autoimmunity Screening for Kids (ASK), er den første screeningsundersøgelse i den generelle befolkning for type 1-diabetes (T1D) og cøliaki i USA. Med coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19) -pandemien er epidemiologien af COVID-19 i den generelle befolkning og viden om sammenhængen mellem COVID-19-infektion og T1D-udvikling presserende. Den nuværende standardscreeningsmetode for radiobindingsassay (RBA) har mødt to store udfordringer: lav effektivitet med et enkelt analyseformat og lav sygdomsspecificitet med en stor andel af antistoffer med lav affinitet genereret ved screening. Med platformen for multiplex elektrokemiluminescens (ECL) assay, vi etablerede tidligere, blev der udviklet et nyt 6-Plex ECL-assay, der kombinerer i en enkelt brønd alle fire ø-autoantistoffer (IAbs) til insulin, glutaminsyre decarboxylase (GAD65), insulinomantigen 2 (IA-2) og zinktransportør 8 (ZnT8) til T1D, transglutaminase autoantistoffer (TGA) til cøliaki og alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) receptorbindende domæne (RBD) antistoffer til COVID-19. Analysen blev valideret i blinde ved hjælp af 880 prøver fra ASK-undersøgelsen, herunder 325 positive prøver og 555 alle antistofnegative prøver, og sammenlignet med standard RBA’erne og et enkelt ECL-assay. Med fordelene ved høj effektivitet, lave omkostninger og lav serumvolumen er dette assay blevet accepteret som det primære screeningsværktøj til ASK-undersøgelsen.
Store epidemiologiske undersøgelser over hele verden viser, at forekomsten af type 1-diabetes (T1D) har været hurtigt stigende med 3%-5% årligt, og forekomsten af T1D er fordoblet i de sidste 20 år, især hos små børn 1,2. Ø autoantistoffer (IAbs) forekommer normalt år før kliniske symptomer og er i øjeblikket de mest pålidelige prædiktive og diagnostiske biomarkører for T1D3. Screening for T1D-autoantistoffer kan identificere personer med risiko for at komme videre til klinisk T1D, uddanne offentligheden, stort set reducere den livstruende komplikation af ketoacidose og gavne kliniske forsøg med forebyggelsesterapier. Verdensomspændende forebyggelsesindsats for T1D er i gang, og flere interventionelle forsøg udføres blandt forsøgspersoner med IAbs-positive for at forsinke progressionen til klinisk T1D, og Barbara Davis Center for Diabetes lancerede det første amerikanske kliniske forsøg med screening i den generelle befolkning i 2016 for T1D og cøliaki, Autoimmunitetsscreening for børnene (ASK)4 . Cøliaki (CD) er en kronisk intestinal inflammatorisk sygdom relateret til immun- og genetiske faktorer. Forekomsten af CD hos børn med T1D kan nå op til 24,5%5. Mere end halvdelen af personer med CD kan ikke have typiske symptomer ved præsentation6, så serologisk screening for cøliaki er helt nødvendig.
Siden pandemien med coronavirussygdom 2019 (COVID-19) startede, er der rapporteret over 200 millioner tilfælde globalt, og børn tegner sig for op til 16% af laboratoriebekræftede tilfælde7. Mange undersøgelser har vist virkningen af eksisterende T1D på sværhedsgraden og dødeligheden af COVID-19-infektion8, mens virkningen af COVID-19-infektion på T1D-udvikling ikke er klar. Undersøgelsen af den samlede COVID-19-infektion i den generelle befolkning ved bestemmelse af alvorlige akutte respiratoriske syndrom coronavirus 2 (SARS-COV-2) antistoffer og undersøgelsen af sammenhængen mellem COVID-19-infektion og udløsning af T1D-autoimmunitet eller accelererende T1D-progression er presserende nødvendige og meget vigtige, mens den igangværende ASG-undersøgelse er en glimrende platform for dette. På grund af enkeltassayformatet og genereringen af en stor andel af antistofpositivitet med lav affinitet har standard radiobindingsassay (RBA) mødt en flaskehals med lav effektivitet og lav sygdomsspecificitet9. I dette papir præsenterer vi et nyt 6-Plexed elektrokemiluminescens (ECL) assay bygget på vores tidligere multiplex ECL-analyseplatform ved hjælp af en multiple-Plex-plade, der kombinerer seks autoantistofassays i en enkelt brønd, herunder alle fire store IAb’er til insulin (IAA), glutaminsyre decarboxylase-65 (GADA), insulinomantigen-2 (IA-2A) og zinktransport-8 (ZnT8A), autoantistoffer til transglutaminase (TGA) til cøliaki, og SARS-CoV-2 receptorbindende domæne (RBD) antistoffer (COVID-19A). Dette er det første multiplex-assay, der rekrutterede et komplet panel af fire store IAb’er og yderligere kombinerede dette med TGA og COVID-19A. Det er blevet valideret og formelt accepteret som det primære screeningsværktøj, der erstatter standard RBA i ASK-undersøgelsen.
Interventionen for T1D er gået ind i præ-T1D-æraen, med igangværende nationale og internationale store screeningsprogrammer for T1D og blomstrende kliniske forsøg, der anvendes i fase 1 T1D for at ophæve eller bremse progressionen til klinisk T1D12,13. Målinger af fire IAbs ved hjælp af den nuværende standard RBA med et enkelt IAb-analyseformat er besværligt og ineffektivt for et massescreeningsprogram. Med den presserende efterspørgsel efter et multiplekset IAbs-assay med høj kapacitet er multiplekset ECL-assay, 3-Screen ICA ELISA og antistofdetektion ved agglutinations-PCR (ADAP) opstået som aktuelt konkurrencedygtige teknologier. I Fr1da-undersøgelsen af screening for T1D i en population af små børn i Tyskland blev 3-Screen ICA ELISA, der kombinerede 3 IAbs (GADA, IA-2A og ZnT8A) anvendt som hovedtest14. En stor begrænsning af 3-skærms ICA ELISA er manglen på IAA, som for det meste er den første IAb, der vises med en høj forekomst hos små børn med T1D. Desuden er analysen ikke i stand til at skelne mellem, hvilken af de tre IAbs der er positiv fra et positivt signal, og hver positiv prøve skal gentages med tre enkeltassays til bekræftelse. ADAP15 kombinerer GADA, IA-2A og IAA og illustrerede høj analysefølsomhed og specificitet i IASP-workshoppen, men mangler data om, hvor forudsigelig den er i populationsbaseret screening for T1D-undersøgelser, som IASP-værkstedet ikke er i stand til at bestemme. Multiplex ECL-analysen i denne undersøgelse er bygget på platformen for et enkelt ECL-assay, der er valideret mod den nuværende standard RBA i flere kliniske forsøg som TrailNet9,16, DAISY17,18,19 og ASK 4,20,21 studium. Det foreliggende assay er blevet valideret mod både RBA og enkelt ECL-assay ved hjælp af 880 serumprøver fra deltagere i ASK-undersøgelsen. Som vist i figur 2 og figur 3 var antistofniveauer mellem 6-Plex og enkelt ECL eller mellem 6-Plex og RBA for det meste kongruente med hinanden for antistoffernes positivitet. Sammenfaldsraterne for IAbs testet af RBA og 6-Plex var 91,7%-97,8%, og sammenfaldsraterne for IAbs testet med enkelt ECL og 6-Plex var 95,3%-99,2%. Uoverensstemmelse mellem ECL-analysen og RBA var hovedsageligt fra dem med enkelt IAb. Niveauerne af IAbs testet af 6-Plex og enkelt ECL (r = 0,6431-0,9434, alle p < 0,0001) og 6-Plex og RBA (r = 0,5775-0,8576, alle p < 0,0001) var også godt korreleret. TGA testet ved 6-Plex-assay var stærkt korreleret med resultaterne af både RBA (99,4%) og enkelt ECL-assay (99,4%). Derudover nåede COVID-19A testet af 6-Plex 99.8% overholdelse af resultaterne af det enkelte ECL-assay.
Som følge heraf er 6-Plex ECL-analysen formelt blevet accepteret som den primære screeningsmetode for den igangværende ASK-undersøgelse og erstattet standard RBA22. Dette assay demonstrerede dets fremragende følsomhed og specificitet med højere gennemstrømning, lavere omkostninger og mindre volumen serum sammenlignet med standard RBA.
Det er dokumenteret, at i T1D-screeningsstudiet var enkelt IAb påvist af RBA, som optog en stor del af IAb-positiviteterne, af lav affinitet, med lav sygdomsrisiko og resulterede i en samlet lav prædiktiv værdi 19,21,23,24,25,26. En sådan forudsigelse med lav risiko medførte enorme ekstraomkostninger ved opfølgende besøg og resulterede i vanskeligheder for forebyggende T1D-undersøgelser. Den etablerede ECL-analyseplatform er blevet demonstreret i flere kliniske forsøg for at diskriminere IAb’er med høj affinitet fra IAb’er med lav affinitet genereret af RBA og signifikant forbedre de forudsigelige værdier for alle fire IAb’er, især med enkelt IAb-positivitet16,17,18,21 . Multiplex ECL-analyseteknologien blev bygget på platformen for det enkelte ECL-assay med denne tydelige fordel ved påvisning af abs-abs med høj affinitet. I denne undersøgelse illustrerede 6-Plex ECL-analysen sin lighed med de tilsvarende enkelte ECL-assays i følsomhed og specificitet.
Nogle begrænsninger og de tekniske problemer ved multiplex ECL-analysen ved hjælp af flere Plex-plader er allerede blevet dækket i tidligere publikationer27,28. Med seks mærkede antigener i en brønd kan der være nogle påvirkninger mellem forskellige antigener, og analysebaggrunden kan øges, når der tilføjes hvert antistofassay til multiplexing i samme brønd. En stor mængde analyseoptimeringsarbejde er nødvendigt for at justere analysebetingelserne, især for at justere de endelige koncentrationer af hvert mærket antigenprotein baseret på skakbrætassayet for hvert antigen for at opretholde følsomheden og specificiteten for hvert antistofassay. Som nævnt i tidligere undersøgelser27,28 resulterer et lille antal prøver (<1%) i falsk positivitet på multipel Plex-pladen uden en klar underliggende årsag. Alle positive resultater bør gentages og bekræftes ved et enkelt ECL-assay som rutinemæssig kvalitetssikring af laboratorier; Normalt fjernes de falske positiver. Falsk-negative resultater forårsaget af "prozoneeffekten" observeret i det tidligere 7-Plex ECL-assay27,28 blev ikke observeret i denne undersøgelse. I analysen beskrevet her fjernede vi trinnet med syrebehandling af serumprøver fra den tidligere protokol; I stedet forvarmede vi serumprøverne ved 56 °C i 30 minutter (trin 5.1.). På den anden dag med pladevask brugte vi en vaskebuffer indeholdende 0,4 M NaCl (trin 8.1.) i stedet for almindelig vaskebuffer til at vaske pladen strengere. Disse ændringer gjorde multiplex ECL-analysen enklere og lavere baggrund uden at miste analysefølsomheden.
Afslutningsvis har dette assay fremragende ydeevne til påvisning af fire IAbs, TGA og COVID-19A samtidigt. Multiplexing-funktionen såvel som det høje gennemløb, lave omkostninger og små serumvolumenkrav gør storskala screening for T1D og samtidige sygdomme meget mere gennemførlig i den generelle befolkning. Patienter med T1D eller autoimmune sygdomme har en meget højere risiko for andre autoimmune sygdomme. Multiplex ECL-analysen giver en fremragende platform til at screene for T1D og flere autoimmune sygdomme samtidigt.
The authors have nothing to disclose.
Undersøgelsen blev støttet af JDRF-tilskud 2-SRA-2019-695-S-B, 2-SRA-2020-965-S-B, 1-SRA-2017-564-M_N, NIH-tilskud DK32083 og Diabetes Research Center (DRC) tilskud P30 DK116073.
5 mM NaCl | ThermoFisher | 1070832 | |
96-well Plate Shaker | VWR | 12620-926 | |
96-well round bottom plate | Fisher | 8408220 | |
Biotin | ThermoFisher | PI21329 | |
Blocker A | MSD | R93AA | |
Bottle-Top 500 ml-Filter Units | Fisher | 0974064A | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A-7906 | |
GAD65 protein | Diamyd Medical | 10-65702-01 | |
IA-2 protein (aa 605-979) | Creative BioMart | 283309 | |
MESO QuickPlex SQ120 | MSD | R31QQ-3 | Electrochemiluminescence analyzer |
PBS 10x | ThermoFisher | 70011044 | |
PBS 1x | ThermoFisher | 10010023 | |
Proinsulin protein | AmideBio | 20160118B3 | |
Read buffer B | MSD | Y0800019 | |
SARS-CoV-2 RBD protein | Creative Biomart | Spike-190V | |
Stop Solution | MSD | Y0090019 | |
Sulfo-TAG | MSD | R91AO-1 | |
tTG protein | Diarect AG | 15201 | |
Tween 20 | Sigma | P-1379 | |
U-Plex 6-Assay SECTOR plate | MSD | Z00U0142E | 6-plex plate |
U-PLEX Linker 1 | MSD | L0010022 | |
U-PLEX Linker 10 | MSD | L0100020 | |
U-PLEX Linker 2 | MSD | L0020015 | |
U-PLEX Linker 3 | MSD | L0030018 | |
U-PLEX Linker 8 | MSD | L0080018 | |
U-PLEX Linker 9 | MSD | L0090014 | |
ZeBa Column | ThermoFisher | 89892 | Spin columns |
ZnT8 protein | Research Laboratory | n/a |