वर्तमान प्रोटोकॉल एक कस्टम-निर्मित यूवी रोशनी डिवाइस का उपयोग करके 3 डी मैट्रिक्स-माइमेटिक संस्कृतियों में रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा कोशिकाओं के कीमोथेरेप्यूटिक प्रतिक्रियाओं पर यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों के प्रभावों का आकलन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच का वर्णन करता है, जो ट्यून करने योग्य यांत्रिक विशेषताओं के साथ हाइड्रोगेल के उच्च-थ्रूपुट फोटोक्रॉसलिंकिंग की सुविधा प्रदान करता है।
सेल-मैट्रिक्स इंटरैक्शन जैव रासायनिक, यांत्रिक और ज्यामितीय संकेतों के माध्यम से जटिल शारीरिक प्रक्रियाओं की मध्यस्थता करते हैं, जो रोग संबंधी परिवर्तनों और चिकित्सीय प्रतिक्रियाओं को प्रभावित करते हैं। दवा विकास पाइपलाइन में पहले मैट्रिक्स प्रभावों के लिए लेखांकन उपन्यास चिकित्सीय की नैदानिक सफलता की संभावना को बढ़ाने की उम्मीद है। 3 डी सेल संस्कृति में विशिष्ट ऊतक माइक्रोएन्वायरमेंट को पुन: पेश करने वाली बायोमैटेरियल-आधारित रणनीतियां मौजूद हैं, लेकिन मुख्य रूप से दवा स्क्रीनिंग के लिए उपयोग की जाने वाली 2 डी संस्कृति विधियों के साथ इन्हें एकीकृत करना चुनौतीपूर्ण रहा है। इस प्रकार, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल मौजूदा दवा स्क्रीनिंग पाइपलाइनों और सेल व्यवहार्यता के लिए पारंपरिक परख के साथ एकीकरण की सुविधा के लिए एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप में लघु बायोमैटेरियल मैट्रिक्स के भीतर 3 डी संस्कृति के तरीकों के विकास का विवरण देता है। चूंकि सुसंस्कृत कोशिकाओं में नैदानिक रूप से प्रासंगिक फेनोटाइप को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण मैट्रिक्स सुविधाओं को अत्यधिक ऊतक- और रोग-विशिष्ट होने की उम्मीद है, इसलिए विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त परिस्थितियों की पहचान करने के लिए मैट्रिक्स मापदंडों की संयोजन स्क्रीनिंग आवश्यक होगी। यहां वर्णित विधियां मैट्रिक्स यांत्रिकी और लिगैंड प्रस्तुति के ऑर्थोगोनल भिन्नता के लिए कैंसर सेल प्रतिक्रियाओं का आकलन करने के लिए एक लघु संस्कृति प्रारूप का उपयोग करती हैं। विशेष रूप से, यह अध्ययन कीमोथेरेपी के लिए रोगी-व्युत्पन्न ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं पर मैट्रिक्स मापदंडों के प्रभावों की जांच करने के लिए इस मंच के उपयोग को दर्शाता है।
एक नई दवा विकसित करने की अपेक्षित लागत पिछले एक दशक में लगातार बढ़ी है,वर्तमान अनुमानों में $ 1 बिलियन से अधिक है। इस खर्च का एक हिस्सा नैदानिक परीक्षणों में प्रवेश करने वाली दवाओं की उच्च विफलता दर है। लगभग 12% दवा उम्मीदवार अंततः 2019 में संयुक्त राज्य अमेरिका (यूएस) खाद्य एवं औषधि प्रशासन (एफडीए) से अनुमोदन अर्जित करते हैं। अप्रत्याशित विषाक्तता2 के कारण चरण 1 में कई दवाएं विफल हो जाती हैं, जबकि अन्य जो सुरक्षा परीक्षणों को पारित करती हैं, प्रभावकारिता की कमी के कारण विफल हो सकतीहैं 3. गैर-प्रभावकारिता के कारण इस एट्रिशन को आंशिक रूप से इस तथ्य से समझाया जा सकता है कि दवा के विकास के दौरान उपयोग किए जाने वाले कैंसर मॉडल नैदानिक प्रभावकारिता के कुख्यात गैर-पूर्वानुमानित हैं4.
इन विट्रो और इन विवो मॉडल के बीच कार्यात्मक असमानताओं को उनके मूल माइक्रोएन्वायरमेंट से कैंसर कोशिकाओं को हटाने के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, जिसमें गैर-ट्यूमर कोशिकाएं और भौतिक ईसीएम 5,6 शामिल हैं। आमतौर पर, अनुसंधान समूह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति मैट्रिक्स का उपयोग करते हैं, जैसे मैट्रिगेल (माउस सारकोमा से प्राप्त एक प्रोटीनयुक्त तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स) 3 डी मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ सुसंस्कृत ट्यूमर कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए। 2 डी संस्कृति की तुलना में, झिल्ली मैट्रिक्स में 3 डी संस्कृति ने इन विट्रो परिणाम7,8 की नैदानिक प्रासंगिकता में सुधार किया है। हालांकि, झिल्ली मैट्रिक्स सहित विकोशिकीय ऊतकों से संस्कृति बायोमैटेरियल्स, आमतौर पर बैच-टू-बैच परिवर्तनशीलता प्रदर्शित करते हैं जो प्रजनन क्षमता9 से समझौता कर सकते हैं। इसके अलावा, अध्ययन किए गए लोगों से विभिन्न ऊतक उत्पत्ति वाले ट्यूमर से प्राप्त मैट्रिक्स उपयुक्त शारीरिक संकेत प्रदान नहीं कर सकतेहैं 10. अंत में, इंट्राट्यूमोरल विषमता की उच्च डिग्री वाले कैंसर में सूक्ष्म पर्यावरणीय विशेषताएं होती हैं जो सबमाइक्रोन आकार के पैमाने पर भिन्न होती हैं और जो झिल्ली मैट्रिक्स को11 को पुन: प्राप्त करने के लिए ट्यून नहीं किया जा सकता है।
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम), लगभग 15 महीने के औसत जीवित रहने के समय के साथ एक समान रूप से घातक मस्तिष्क ट्यूमर, एक कैंसर है जिसके लिए उपचार का विकास विशेष रूप से कठिन12,13 रहा है। जीबीएम के लिए देखभाल के वर्तमान मानक में प्राथमिक ट्यूमर लकीर शामिल है, इसके बाद रेडियोथेरेपी, और फिर टेमोज़ोलोमाइड (टीएमजेड) 14 का उपयोग करके कीमोथेरेपी। फिर भी, आधे से अधिक नैदानिक जीबीएम ट्यूमर विभिन्नतंत्रों 15,16,17 के माध्यम से उपचार प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। एक व्यक्तिगत रोगी के लिए उपचार आहार की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करना बेहद मुश्किल है। व्यक्तिगत परिणामों की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोग किए जाने वाले मानक प्रीक्लिनिकल मॉडल में रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाएं शामिल होती हैं जो इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड चूहों में ऑर्थोटोपिक रूप से होती हैं। जबकि रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट नैदानिक जीबीएम ट्यूमर के कई पहलुओं को दोहरा सकते हैं और प्रीक्लिनिकल मॉडल18 के लिए मूल्यवान हैं, वे स्वाभाविक रूप से महंगे, कम थ्रूपुट, समय लेने वाले हैं, और नैतिक चिंताओं को शामिल करते हैं19. रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाओं की संस्कृतियां, 2 डी प्लास्टिक की सतहों पर या स्फेरॉइड के रूप में, ज्यादातर इन मुद्दों से बचती हैं। जबकि रोगी-व्युत्पन्न कोशिकाएं आनुवंशिक विपथन को संरक्षित करती हैं, 2 डी में या निलंबित स्फेरॉइड के रूप में उनकी संस्कृतियां कृन्तकों और मूल रोगी ट्यूमर20 में रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट के काफी हद तक खराब प्रतिनिधित्व रही हैं। इससे पहले, हमने, और अन्य लोगों ने दिखाया है कि 3 डी ईसीएम में सुसंस्कृत जीबीएम कोशिकाएं जो मस्तिष्क के ऊतकों के यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों की नकल करती हैं, दवा प्रतिरोध फेनोटाइप 10,21,22,23 को संरक्षित कर सकती हैं।
हाइलूरोनिक एसिड (एचए) के बीच बातचीत, मस्तिष्क ईसीएम में प्रचुर मात्रा में एक पॉलीसेकेराइड और जीबीएम ट्यूमर में अतिरंजित, और इसके सीडी 44 रिसेप्टर इन विट्रो21,24,25,26,27 में दवा प्रतिरोध के अधिग्रहण को संशोधित करते हैं। उदाहरण के लिए, नरम, 3 डी संस्कृतियों के भीतर एचए को शामिल करने से चिकित्सीय प्रतिरोध प्राप्त करने के लिए रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की क्षमता में वृद्धि हुई। यह मैकेनो-उत्तरदायित्व जीबीएम कोशिकाओं21 पर सीडी 44 रिसेप्टर्स के लिए एचए बाध्यकारी पर निर्भर था। इसके अतिरिक्त, आरजीडी-असर पेप्टाइड्स के लिए एकीकृत बाध्यकारी, 3 डी संस्कृति मैट्रिक्स में शामिल, कठोरता-निर्भर तरीके से प्रवर्धित सीडी 44-मध्यस्थता कीमोरेसिस्टेंस21. एचए से परे, कई ईसीएम प्रोटीन की अभिव्यक्ति, आरजीडी क्षेत्रों वाले कई, सामान्य मस्तिष्क और जीबीएम ट्यूमर28 के बीच भिन्न होते हैं। उदाहरण के लिए, एक अध्ययन ने बताया कि जीबीएम ट्यूमर29 में 28 अलग-अलग ईसीएम प्रोटीन को अपग्रेड किया गया था। इस जटिल ट्यूमर मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर, कैंसर कोशिकाएं एक विशेष प्रतिरोध फेनोटाइप उत्पन्न करने के लिए यांत्रिक और जैव रासायनिक संकेतों को एकीकृत करती हैं, जो यंग के मापांक या इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड्स 28,29,30 के घनत्व में अपेक्षाकृत छोटे अंतर (जैसे, परिमाण के क्रम से कम) पर निर्भर करती हैं।
वर्तमान प्रोटोकॉल विशेषता है कि ट्यूमर कोशिकाएं मैट्रिक्स संकेतों के अद्वितीय संयोजनों की व्याख्या कैसे करती हैं और उपचार प्रतिरोध (चित्रा 1 ए) को बढ़ावा देने वाले जटिल, रोगी-विशिष्ट मैट्रिक्स माइक्रोएन्वायरमेंट की पहचान करती हैं। 3 डी संस्कृति के लिए लघु, सटीक रूप से ट्यून किए गए मैट्रिक्स उत्पन्न करने के लिए एक फोटोकेमिकल विधि एक बड़ा, ऑर्थोगोनल चर स्थान प्रदान करती है। माइक्रोकंट्रोलर द्वारा संचालित एलईडी की एक कस्टम-निर्मित सरणी को स्वचालन और प्रजनन क्षमता बढ़ाने के लिए 384-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप के भीतर फोटोक्रॉसलिंक हाइड्रोगेल में शामिल किया गया था। एक्सपोजर तीव्रता परिणामी हाइड्रोगेल के सूक्ष्म-यांत्रिक गुणों को बदलने के लिए अच्छी तरह से विविध थी, जैसा कि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था। हालांकि यह पांडुलिपि रोशनी सरणी के निर्माण पर ध्यान केंद्रित नहीं करती है, एक सर्किट आरेख (चित्रा 1 बी) और भागों की सूची (सामग्री की तालिका) डिवाइस प्रजनन के लिए एड्स के रूप में प्रदान की जाती है।
यह रिपोर्ट अद्वितीय, 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट में सुसंस्कृत जीबीएम कोशिकाओं की एक सरणी की तेजी से पीढ़ी को दर्शाती है जिसमें यंग के मापांक (परिमाण के एक ही क्रम में चार स्तर) और इंटीग्रिन-बाइंडिंग पेप्टाइड सामग्री (चार अलग-अलग ईसीएम प्रोटीन से व्युत्पन्न) ऑर्थोगोनली विविध थे। दृष्टिकोण का उपयोग तब रोगी-व्युत्पन्न जीबीएम कोशिकाओं की व्यवहार्यता और प्रसार पर हाइड्रोगेल यांत्रिकी और ईसीएम-विशिष्ट एकीकृत सगाई के सापेक्ष योगदान की जांच करने के लिए किया गया था क्योंकि वे टेमोज़ोलोमाइड (टीएमजेड) कीमोथेरेपी के प्रतिरोध को प्राप्त करते हैं।
वर्तमान कार्य एचए-आधारित के भीतर 3 डी, लघु संस्कृतियों को उत्पन्न करने के तरीकों को प्रस्तुत करता है, जबकि एक साथ मैट्रिक्स कठोरता और एकीकृत सगाई के लिए उपलब्ध पेप्टाइड्स को बदलता है। यह तकनीक व्यवस्थि?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक विशेष रूप से कैरोलिन किम, अमेलिया लाओ, रयान स्टाउटमोर और इटाय सोलोमन को फोटोगेलेशन योजना के पहले पुनरावृत्तियों में उनके योगदान के लिए स्वीकार करना चाहते हैं। सेल लाइनें जीएस 122 और जीएस 304 उदारतापूर्वक डेविड नाथनसन द्वारा प्रदान की गई थीं। सभी आंकड़े BioRender.com के साथ बनाए गए थे। यूसीएलए कोर सुविधाएं, आणविक स्क्रीनिंग साझा संसाधन, और नैनो और पिको लक्षण वर्णन प्रयोगशाला काम के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी। चेन चिया-चुन को यूसीएलए एली और एडिथ ब्रॉड सेंटर ऑफ रीजनरेटिव मेडिसिन एंड स्टेम सेल रिसर्च ट्रेनिंग प्रोग्राम द्वारा समर्थित किया गया था। ग्रिगोर वरुझानियन को ट्यूमर सेल बायोलॉजी ट्रेनिंग प्रोग्राम एनआईएच ग्रांट (टी 32 सीए 009056) द्वारा समर्थित किया गया था।
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |