تمكن صفائف الهيدروجيل من زيادة الإنتاجية لفحص تأثيرات مكونات المصفوفة والعلاجات في نماذج الأورام 3D
Summary
يصف هذا البروتوكول منصة تجريبية لتقييم آثار الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية على استجابات العلاج الكيميائي لخلايا الورم الأرومي الدبقي المشتقة من المريض في مزارع محاكاة مصفوفة 3D باستخدام جهاز إضاءة الأشعة فوق البنفسجية المصنوع خصيصا لتسهيل الربط الضوئي عالي الإنتاجية للهيدروجيل مع ميزات ميكانيكية قابلة للضبط.
Abstract
تتوسط تفاعلات مصفوفة الخلايا العمليات الفسيولوجية المعقدة من خلال الإشارات الكيميائية الحيوية والميكانيكية والهندسية ، مما يؤثر على التغيرات المرضية والاستجابات العلاجية. ومن المتوقع أن يؤدي حساب آثار المصفوفة في وقت مبكر من خط أنابيب تطوير الأدوية إلى زيادة احتمال النجاح السريري للعلاجات الجديدة. توجد استراتيجيات قائمة على المواد الحيوية تلخص بيئات دقيقة محددة للأنسجة في زراعة الخلايا 3D ولكن دمجها مع طرق زراعة 2D المستخدمة في المقام الأول لفحص الأدوية كان تحديا. وبالتالي ، فإن البروتوكول المقدم هنا يفصل تطوير طرق لزراعة 3D داخل مصفوفات المواد الحيوية المصغرة في شكل لوحة متعددة الآبار لتسهيل التكامل مع خطوط أنابيب فحص الأدوية الحالية والفحوصات التقليدية لصلاحية الخلية. وبما أنه من المتوقع أن تكون ميزات المصفوفة الحاسمة الأهمية للحفاظ على الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا في الخلايا المستزرعة خاصة بالأنسجة والأمراض، فإن الفحص التوافقي لبارامترات المصفوفة سيكون ضروريا لتحديد الظروف المناسبة لتطبيقات محددة. تستخدم الطرق الموضحة هنا تنسيق ثقافة مصغر لتقييم استجابات الخلايا السرطانية للتباين المتعامد لميكانيكا المصفوفة وعرض الرباط. على وجه التحديد ، توضح هذه الدراسة استخدام هذه المنصة للتحقيق في آثار معلمات المصفوفة على استجابات خلايا الورم الأرومي الدبقي (GBM) المشتقة من المريض للعلاج الكيميائي.
Introduction
ارتفعت التكلفة المتوقعة لتطوير دواء جديد بشكل مطرد على مدى العقد الماضي ، مع أكثر من مليار دولار في التقديرات الحالية1. جزء من هذه النفقات هو ارتفاع معدل فشل الأدوية التي تدخل التجارب السريرية. ما يقرب من 12٪ من الأدوية المرشحة تحصل في نهاية المطاف على موافقة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) في عام 2019. تفشل العديد من الأدوية في المرحلة الأولى بسبب السمية غير المتوقعة2 ، في حين أن الأدوية الأخرى التي تجتاز تجارب السلامة قد تفشل بسبب نقص الفعالية3. يمكن تفسير هذا الاستنزاف بسبب عدم الفعالية جزئيا بحقيقة أن نماذج السرطان المستخدمة أثناء تطوير الأدوية غير تنبؤية بالفعالية السريرية4.
يمكن أن تعزى التفاوتات الوظيفية بين النماذج المختبرية ونماذج الجسم الحي إلى إزالة الخلايا السرطانية من بيئتها الدقيقة الأصلية ، بما في ذلك الخلايا غير السرطانية و ECM 5,6 المادي. عادة ، تستخدم مجموعات البحث مصفوفات استزراعية متاحة تجاريا ، مثل Matrigel (مصفوفة غشاء قبو بروتينية مشتقة من ساركوما الفئران) لتزويد الخلايا السرطانية المستزرعة ببيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد. بالمقارنة مع ثقافة 2D ، حسنت ثقافة 3D في مصفوفة الغشاء من الأهمية السريرية للنتائج في المختبر 7,8. ومع ذلك ، فإن المواد الحيوية المستزرعة من الأنسجة الخالية من الخلايا ، بما في ذلك مصفوفة الغشاء ، عادة ما تظهر تباينا من دفعة إلى أخرى قد يعرض للخطر قابلية التكاثر9. علاوة على ذلك ، قد لا توفر المصفوفات المشتقة من الأورام ذات الأصول النسيجية المختلفة عن تلك التي تمت دراستها الإشارات الفسيولوجية المناسبة10. وأخيرا، فإن السرطانات ذات الدرجات العالية من عدم التجانس داخل الفخذ لها سمات بيئية دقيقة تختلف على نطاق دون الميكرون ولا يمكن ضبط مصفوفة الغشاء لتلخيصها11.
الورم الأرومي الدبقي (GBM) ، وهو ورم دماغي قاتل بشكل موحد مع متوسط وقت البقاء على قيد الحياة لمدة 15 شهرا تقريبا ، هو سرطان كان تطوير العلاج له صعبا بشكل خاص12,13. يتكون المعيار الحالي لرعاية GBM من استئصال الورم الأولي ، يليه العلاج الإشعاعي ، ثم العلاج الكيميائي باستخدام temozolomide (TMZ)14. ومع ذلك ، فإن أكثر من نصف أورام GBM السريرية تظهر مقاومة للعلاج من خلال آليات مختلفة15،16،17. من الصعب للغاية التنبؤ بفعالية نظام العلاج لمريض فردي. تتكون النماذج القياسية قبل السريرية المستخدمة للتنبؤ بالنتائج الفردية من خلايا الورم المشتقة من المريض والتي يتم تطعيمها بشكل تقويمي في الفئران التي تعاني من نقص المناعة. في حين أن xenografts المشتقة من المريض يمكن أن تلخص العديد من جوانب أورام GBM السريرية وهي ذات قيمة للنماذج قبل السريرية18 ، إلا أنها مكلفة بطبيعتها ، وإنتاجية منخفضة ، وتستغرق وقتا طويلا ، وتنطوي على مخاوف أخلاقية19. مزارع الخلايا المشتقة من المريض ، على الأسطح البلاستيكية 2D أو كروية ، في الغالب تجنب هذه القضايا. في حين أن الخلايا المشتقة من المريض تحافظ على الانحرافات الجينية ، فإن ثقافاتها في 2D أو كرويات معلقة كانت إلى حد كبير تمثيلات ضعيفة للأزينوفاتات المشتقة من المريض في القوارض وأورام المرضى الأصلية20. في السابق ، أظهرنا ، ونحن ، وآخرون ، أن خلايا GBM المستزرعة في ECM 3D التي تحاكي الخصائص الميكانيكية والكيميائية الحيوية لأنسجة المخ يمكن أن تحافظ على الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية10،21،22،23.
التفاعلات بين حمض الهيالورونيك (HA) ، وهو عديد السكاريد الوفير في الدماغ ECM والمبالغة في التعبير عنه في أورام GBM ، ومستقبلات CD44 الخاصة به تعدل اكتساب مقاومة الأدوية في المختبر21،24،25،26،27. على سبيل المثال ، أدى إدراج HA ضمن ثقافات 3D الناعمة إلى زيادة قدرة خلايا GBM المشتقة من المريض على اكتساب مقاومة علاجية. كانت هذه المسؤولية الميكانيكية تعتمد على ارتباط HA بمستقبلات CD44 على خلايا GBM21. بالإضافة إلى ذلك ، فإن ربط integrin بالببتيدات الحاملة ل RGD ، المدمجة في مصفوفات الثقافة ثلاثية الأبعاد ، يضخم المقاومة الكيميائية بوساطة CD44 بطريقة تعتمد على الصلابة21. أبعد من HA ، يختلف التعبير عن العديد من بروتينات ECM ، التي يحتوي العديد منها على مناطق RGD ، بين أورام الدماغ الطبيعية و GBM28. على سبيل المثال ، ذكرت إحدى الدراسات أن 28 بروتينا متميزا من بروتينات ECM تم تنظيمها في أورام GBM29. ضمن هذه البيئة الدقيقة المعقدة لمصفوفة الورم ، تدمج الخلايا السرطانية الإشارات الميكانيكية والكيميائية الحيوية لإنتاج نمط ظاهري مقاوم معين ، والذي يعتمد على اختلافات صغيرة نسبيا (على سبيل المثال ، أقل من ترتيب الحجم) في معامل يونغ أو كثافة الببتيدات المرتبطة بالتكامل28،29،30.
يميز هذا البروتوكول كيف تفسر الخلايا السرطانية مجموعات فريدة من إشارات المصفوفة وتحدد البيئات الدقيقة المعقدة الخاصة بالمريض والتي تعزز مقاومة العلاج (الشكل 1A). توفر الطريقة الكيميائية الضوئية لتوليد مصفوفات مصغرة ومضبوطة بدقة لثقافة 3D مساحة متغيرة كبيرة ومتعامدة . تم دمج مجموعة مصممة خصيصا من مصابيح LED ، التي تديرها وحدة تحكم دقيقة ، في الهلاميات المائية الضوئية المتقاطعة ضمن تنسيق لوحة 384 بئر لزيادة الأتمتة وقابلية التكرار. وتباينت شدة التعرض عبر البئر لتغيير الخواص الميكانيكية الدقيقة للهيدروجيل الناتج، كما تم تقييمها باستخدام مجهر القوة الذرية (AFM). في حين أن هذه المخطوطة لا تركز على بناء مصفوفة الإضاءة نفسها، يتم توفير مخطط الدائرة (الشكل 1B) وقائمة الأجزاء (جدول المواد) كمساعدات لإعادة إنتاج الجهاز.
يوضح هذا التقرير التوليد السريع لمجموعة من خلايا GBM المستزرعة في بيئات دقيقة فريدة من نوعها ثلاثية الأبعاد حيث كان معامل يونغ (أربعة مستويات عبر ترتيب واحد من الحجم) ومحتوى الببتيد المرتبط بالتكامل (المشتق من أربعة بروتينات ECM مختلفة) متعامدا. ثم تم استخدام هذا النهج للتحقيق في المساهمات النسبية لميكانيكا الهيدروجيل ومشاركة الإنتينجين الخاصة ب ECM على جدوى وانتشار خلايا GBM المشتقة من المريض لأنها تكتسب مقاومة للعلاج الكيميائي temozolomide (TMZ).
Protocol
Representative Results
Discussion
يقدم العمل الحالي طرقا لتوليد 3D ، ثقافات مصغرة داخل HA القائمة على تغيير صلابة المصفوفة والببتيدات المتاحة للمشاركة في Integrin. تمكن هذه التقنية من الدراسة المنهجية لكيفية تأثير معلمات المصفوفة على الأنماط الظاهرية الخلوية (على سبيل المثال ، صلاحية الخلايا السرطانية المعرضة للعلاج الكيميائ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يعربوا عن تقديرهم على وجه التحديد لكارولين كيم وأميليا لاو وريان ستوتامور وإيتاي سولومون لمساهماتهم في التكرارات السابقة لمخطط التبشير الضوئي. تم توفير خطوط الخلايا GS122 و GS304 بسخاء من قبل ديفيد ناثانسون. تم إنشاء جميع الأرقام مع BioRender.com. وكانت المرافق الأساسية لجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس، والموارد المشتركة للفحص الجزيئي، ومختبر توصيف النانو وبيكو مفيدة في هذا العمل. تم دعم تشن شيا تشون من قبل جامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس إيلي ومركز إديث برود للطب التجديدي وبرنامج التدريب على أبحاث الخلايا الجذعية. تم دعم Grigor Varuzhanyan من قبل برنامج التدريب على بيولوجيا الخلايا السرطانية NIH Grant (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
Riferimenti
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimica. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Ricerca sul cancro. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
