Das vorliegende Protokoll beschreibt eine experimentelle Plattform zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer und biochemischer Hinweise auf chemotherapeutische Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen in 3D-matrixmimetischen Kulturen unter Verwendung eines maßgeschneiderten UV-Beleuchtungsgeräts, das die Hochdurchsatz-Photovernetzung von Hydrogelen mit abstimmbaren mechanischen Eigenschaften ermöglicht.
Zell-Matrix-Interaktionen vermitteln komplexe physiologische Prozesse durch biochemische, mechanische und geometrische Hinweise und beeinflussen pathologische Veränderungen und therapeutische Reaktionen. Es wird erwartet, dass die Berücksichtigung von Matrixeffekten zu einem früheren Zeitpunkt in der Arzneimittelentwicklungspipeline die Wahrscheinlichkeit des klinischen Erfolgs neuartiger Therapeutika erhöhen wird. Es gibt auf Biomaterialien basierende Strategien, die spezifische Gewebemikroumgebungen in 3D-Zellkultur rekapitulieren, aber die Integration dieser mit den 2D-Kulturmethoden, die hauptsächlich für das Drogenscreening verwendet werden, war eine Herausforderung. Daher beschreibt das hier vorgestellte Protokoll die Entwicklung von Methoden für die 3D-Kultur in miniaturisierten Biomaterialmatrizen in einem Multi-Well-Plattenformat, um die Integration in bestehende Wirkstoff-Screening-Pipelines und konventionelle Assays für die Zelllebensfähigkeit zu erleichtern. Da von den Matrixmerkmalen, die für die Erhaltung klinisch relevanter Phänotypen in kultivierten Zellen entscheidend sind, ein hochgradig gewebe- und krankheitsspezifisches Screening erwartet wird, wird ein kombinatorisches Screening von Matrixparametern erforderlich sein, um geeignete Bedingungen für spezifische Anwendungen zu identifizieren. Die hier beschriebenen Methoden verwenden ein miniaturisiertes Kulturformat, um die Reaktionen von Krebszellen auf orthogonale Variation der Matrixmechanik und der Ligandenpräsentation zu bewerten. Insbesondere zeigt diese Studie die Verwendung dieser Plattform, um die Auswirkungen von Matrixparametern auf die Reaktionen von patientenabgeleiteten Glioblastomzellen (GBM) auf die Chemotherapie zu untersuchen.
Die erwarteten Kosten für die Entwicklung eines neuen Medikaments sind in den letzten zehn Jahren stetig gestiegen, mit über 1 Milliarde US-Dollar in aktuellen Schätzungen1. Ein Teil dieser Kosten ist die hohe Ausfallrate von Medikamenten, die in klinische Studien aufgenommen werden. Etwa 12% der Arzneimittelkandidaten erhalten schließlich im Jahr 2019 die Zulassung der US-amerikanischen Food & Drug Administration (FDA). Viele Medikamente versagen in Phase I aufgrund unvorhergesehener Toxizität2, während andere, die Sicherheitsstudien bestehen, aufgrund mangelnder Wirksamkeitscheitern können 3. Diese Fluktuation aufgrund der Nichtwirksamkeit kann teilweise durch die Tatsache erklärt werden, dass Krebsmodelle, die während der Arzneimittelentwicklung verwendet werden, notorisch nicht prädiktiv für die klinische Wirksamkeitsind 4.
Funktionelle Unterschiede zwischen In-vitro– und In-vivo-Modellen können auf die Entfernung von Krebszellen aus ihrer nativen Mikroumgebung zurückgeführt werden, einschließlich Nicht-Tumorzellen und der physikalischen ECM 5,6. Häufig verwenden Forschungsgruppen kommerziell erhältliche Kulturmatrizen wie Matrigel (eine proteinhaltige Basalmembranmatrix, die von Maussarkomen abgeleitet ist), um kultivierten Tumorzellen eine 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen. Im Vergleich zur 2D-Kultur hat die 3D-Kultur in der Membranmatrix die klinische Relevanz der In-vitro-Ergebnisse verbessert 7,8. Kulturbiomaterialien aus dezellularisierten Geweben, einschließlich der Membranmatrix, weisen jedoch typischerweise eine Variabilität von Charge zu Charge auf, die die Reproduzierbarkeit beeinträchtigenkann 9. Darüber hinaus liefern Matrizen, die von Tumoren stammen, deren Gewebeursprung sich von den untersuchten unterscheidet, möglicherweise nicht die geeigneten physiologischen Hinweise10. Schließlich weisen Krebsarten mit hohem Grad an intratumoraler Heterogenität mikroökologische Merkmale auf, die auf einer Submikrometer-Größenskala variieren und deren Rekapitulation der Membranmatrix nicht abgestimmt werdenkann 11.
Das Glioblastom (GBM), ein gleichmäßig tödlicher Hirntumor mit einer medianen Überlebenszeit von etwa 15 Monaten, ist eine Krebserkrankung, bei der die Behandlungsentwicklung besonders schwierig war12,13. Der derzeitige Behandlungsstandard für GBM besteht aus einer primären Tumorresektion, gefolgt von einer Strahlentherapie und einer anschließenden Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ)14. Dennoch zeigen mehr als die Hälfte der klinischen GBM-Tumoren eine Behandlungsresistenz durch verschiedene Mechanismen15,16,17. Die Vorhersage der Wirksamkeit eines Behandlungsschemas für einen einzelnen Patienten ist äußerst schwierig. Präklinische Standardmodelle, die zur Vorhersage individueller Ergebnisse verwendet werden, bestehen aus von Patienten abgeleiteten Tumorzellen, die orthotopisch in immungeschwächte Mäuse xenotransplantiert werden. Während von Patienten abgeleitete Xenotransplantate viele Aspekte klinischer GBM-Tumoren rekapitulieren können und für präklinische Modellewertvoll sind 18, sind sie von Natur aus teuer, geringer Durchsatz, zeitaufwendig und beinhalten ethische Bedenken19. Kulturen von Patientenzellen, auf 2D-Kunststoffoberflächen oder als Sphäroide vermeiden diese Probleme meistens. Während patientenabgeleitete Zellen genetische Aberrationen bewahren, waren ihre Kulturen in 2D oder als suspendierte Sphäroide weitgehend schlechte Darstellungen von patientenabgeleiteten Xenotransplantaten in Nagetieren und ursprünglichen Patiententumoren20. Zuvor haben wir und andere gezeigt, dass GBM-Zellen, die in einem 3D-ECM kultiviert werden, das die mechanischen und biochemischen Eigenschaften des Hirngewebes nachahmt, die Phänotypen 10,21,22,23 der Arzneimittelresistenz erhalten können.
Wechselwirkungen zwischen Hyaluronsäure (HA), einem Polysaccharid, das im Gehirn-ECM reichlich vorhanden ist und in GBM-Tumoren überexprimiert wird, und seinem CD44-Rezeptor modulieren den Erwerb von Arzneimittelresistenzen in vitro 21,24,25,26,27. Zum Beispiel erhöhte die Einbeziehung von HA in weiche 3D-Kulturen die Fähigkeit von von Patienten abgeleiteten GBM-Zellen, therapeutische Resistenzen zu erlangen. Diese Mechano-Responsivität war abhängig von der HA-Bindung an CD44-Rezeptoren auf GBM-Zellen21. Zusätzlich verstärkte die Integrinbindung an RGD-tragende Peptide, die in 3D-Kulturmatrizen eingebaut wurden, CD44-vermittelte Chemoresistenz in einer steifigkeitsabhängigen Weise21. Über HA hinaus variiert die Expression mehrerer ECM-Proteine, von denen viele RGD-Regionen enthalten, zwischen normalen Hirn- und GBM-Tumoren28. Zum Beispiel berichtete eine Studie, dass 28 verschiedene ECM-Proteine in GBM-Tumoren hochreguliert wurden29. Innerhalb dieser komplexen Tumormatrix-Mikroumgebung integrieren Krebszellen mechanische und biochemische Hinweise, um einen bestimmten Resistenzphänotyp zu erhalten, der von relativ kleinen Unterschieden (z. B. weniger als einer Größenordnung) im Elastizitätsmodul oder der Dichte der integrinbindenden Peptide28,29,30 abhängt.
Das vorliegende Protokoll charakterisiert, wie Tumorzellen einzigartige Kombinationen von Matrixhinweisen interpretieren und komplexe, patientenspezifische Matrixmikroumgebungen identifizieren, die die Behandlungsresistenz fördern (Abbildung 1A). Eine photochemische Methode zur Erzeugung miniaturisierter, präzise abgestimmter Matrizen für die 3D-Kultur bietet einen großen, orthogonalen variablen Raum. Ein speziell angefertigtes Array von LEDs, die von einem Mikrocontroller betrieben werden, wurde integriert, um Hydrogele innerhalb eines 384-Well-Plattenformats zu vernetzen, um die Automatisierung und Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Die Expositionsintensität wurde im gesamten Bohrloch variiert, um die mikromechanischen Eigenschaften der resultierenden Hydrogele zu verändern, wie sie mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) bewertet wurden. Während sich dieses Manuskript nicht auf die Konstruktion des Illuminationsarrays selbst konzentriert, werden ein Schaltplan (Abbildung 1B) und eine Stückliste (Table of Materials) als Hilfsmittel für die Gerätereproduktion bereitgestellt.
Dieser Bericht zeigt die schnelle Erzeugung einer Reihe von GBM-Zellen, die in einzigartigen 3D-Mikroumgebungen kultiviert wurden, in denen der Elastizitätsmodul (vier Ebenen über eine einzige Größenordnung) und der integrinbindende Peptidgehalt (abgeleitet von vier verschiedenen ECM-Proteinen) orthogonal variiert waren. Der Ansatz wurde dann verwendet, um die relativen Beiträge der Hydrogelmechanik und des ECM-spezifischen Integrin-Engagements auf die Lebensfähigkeit und Proliferation von patientenabgeleiteten GBM-Zellen zu untersuchen, wenn sie eine Resistenz gegen Temozolomid (TMZ) -Chemotherapie erwerben.
Die aktuelle Arbeit präsentiert Methoden zur Erzeugung von 3D-, miniaturisierten Kulturen innerhalb von HA-basierten bei gleichzeitiger Veränderung der Matrixsteifigkeit und der für das Integrin-Engagement verfügbaren Peptide. Diese Technik ermöglicht die systematische Untersuchung, wie Matrixparameter zelluläre Phänotypen (z. B. die Lebensfähigkeit von Krebszellen, die einer Chemotherapie ausgesetzt sind) mit erhöhtem Durchsatz beeinflussen. Frühere Ansätze, einschließlich der hier vorgestellten, haben die H…
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore und Itay Solomon ausdrücklich für ihre Beiträge zu früheren Iterationen des Photogelationsschemas danken. Die Zelllinien GS122 und GS304 wurden großzügig von David Nathanson zur Verfügung gestellt. Alle Figuren wurden mit BioRender.com erstellt. Die Kerneinrichtungen der UCLA, die Molecular Screening Shared Resources und das Nano and Pico Characterization Laboratory waren maßgeblich an der Arbeit beteiligt. Chen Chia-Chun wurde von der UCLA Eli und dem Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program unterstützt. Grigor Varuzhanyan wurde durch ein Tumor Cell Biology Training Program NIH Grant (T32 CA 009056) unterstützt.
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |