הפרוטוקול הנוכחי מתאר פלטפורמה ניסיונית להערכת ההשפעות של רמזים מכניים וביוכימיים על תגובות כימותרפיות של תאי גליובלסטומה שמקורם בחולה בתרביות מטריצה-מימטיות תלת-ממדיות באמצעות התקן תאורת UV מותאם אישית המאפשר פוטו-קרוסלינקינג בתפוקה גבוהה של הידרוג’לים עם תכונות מכניות הניתנות לכוונון.
אינטראקציות בין מטריצת תאים מתווכות תהליכים פיזיולוגיים מורכבים באמצעות רמזים ביוכימיים, מכניים וגיאומטריים, ומשפיעות על שינויים פתולוגיים ותגובות טיפוליות. התחשבות בהשפעות מטריצה מוקדם יותר בצנרת פיתוח התרופות צפויה להגדיל את הסבירות להצלחה קלינית של טיפולים חדשניים. קיימות אסטרטגיות מבוססות-חומר ביולוגי המשחזרות מיקרו-סביבה של רקמות ספציפיות בתרבית תאים תלת-ממדית, אך שילובן עם שיטות התרבית הדו-ממדיות המשמשות בעיקר לבדיקת תרופות היה מאתגר. לפיכך, הפרוטוקול המוצג כאן מפרט את פיתוח השיטות לתרבית תלת-ממדית בתוך מטריצות חומריות ביולוגיות ממוזערות בפורמט של לוחות רב-בארים כדי להקל על אינטגרציה עם צינורות סינון תרופות קיימים ומבחנים קונבנציונליים לכדאיות התא. מכיוון שתכונות המטריצה הקריטיות לשימור פנוטיפים רלוונטיים מבחינה קלינית בתאים בתרבית צפויות להיות ספציפיות מאוד לרקמות ולמחלות, יהיה צורך בסינון קומבינטורי של פרמטרי מטריצה כדי לזהות תנאים מתאימים ליישומים ספציפיים. השיטות המתוארות כאן משתמשות בתבנית תרבית ממוזערת כדי להעריך את תגובות התאים הסרטניים לשונות אורתוגונלית של מכניקת המטריצות והצגת הליגנד. באופן ספציפי, מחקר זה מדגים את השימוש בפלטפורמה זו כדי לחקור את ההשפעות של פרמטרי מטריצה על התגובות של תאי גליובלסטומה (GBM) שמקורם בחולה לכימותרפיה.
העלות הצפויה של פיתוח תרופה חדשה עלתה בהתמדה בעשור האחרון, עם יותר ממיליארד דולר בהערכות הנוכחיות1. חלק מהוצאה זו הוא שיעור הכשל הגבוה של תרופות הנכנסות לניסויים קליניים. כ-12% מהמועמדים לתרופות מקבלים בסופו של דבר את אישור מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA) בשנת 2019. תרופות רבות נכשלות בשלב I עקב רעילות בלתי צפויה2, בעוד שאחרות שעוברות ניסויי בטיחות עלולות להיכשל בשל חוסר יעילות3. התשה זו עקב אי-יעילות יכולה להיות מוסברת בחלקה על ידי העובדה שמודלים סרטניים המשמשים במהלך פיתוח תרופות ידועים לשמצה בכך שאינם מנבאים את היעילות הקלינית4.
ניתן לייחס פערים תפקודיים בין מודלים in vitro ו-in vivo להסרת תאים סרטניים מהמיקרו-סביבה הטבעית שלהם, כולל תאים שאינם סרטניים ו-ECM 5,6 הפיזי. בדרך כלל, קבוצות מחקר משתמשות במטריצות תרבית הזמינות מסחרית, כגון Matrigel (מטריצת קרום מרתף חלבונית שמקורה בסרקומות עכברים) כדי לספק לתאי גידול בתרבית מיקרו-סביבה של מטריצה תלת-ממדית. בהשוואה לתרבית דו-ממדית, תרבית תלת-ממדית במטריצת הממברנה שיפרה את הרלוונטיות הקלינית של תוצאות במבחנה 7,8. עם זאת, ביו-חומרים בתרבית מרקמות שעברו דה-תאיזציה, כולל מטריצת הממברנה, מפגינים בדרך כלל שונות מאצווה לאצווה שעלולה לפגוע בשכפול9. יתר על כן, מטריצות שמקורן בגידולים עם מקורות רקמה שונים מאלה שנחקרו עשויות שלא לספק את הרמזים הפיזיולוגיים המתאימים10. לבסוף, לסרטן עם דרגות גבוהות של הטרוגניות תוך-טוראלית יש תכונות מיקרו-סביבתיות המשתנות בסולם בגודל תת-מיקרון ואשר לא ניתן לכוונן את מטריצת הממברנה כדי לשחזר11.
גליובלסטומה (GBM), גידול מוח קטלני אחיד עם זמן הישרדות חציוני של כ -15 חודשים, הוא סרטן שעבורו התפתחות הטיפול הייתה קשה במיוחד12,13. סטנדרט הטיפול הנוכחי ב- GBM מורכב מכריתת גידול ראשונית, ולאחר מכן הקרנות, ולאחר מכן כימותרפיה באמצעות טמוזולומיד (TMZ)14. עם זאת, יותר ממחצית מגידולי ה-GBM הקליניים מפגינים עמידות לטיפול באמצעות מנגנונים שונים 15,16,17. חיזוי היעילות של משטר טיפול עבור מטופל בודד הוא קשה ביותר. מודלים פרה-קליניים סטנדרטיים המשמשים לחיזוי התוצאות האינדיבידואליות מורכבים מתאי גידול שמקורם בחולה, המושתלים באופן אורתוטופי בעכברים מדוכאי חיסון. בעוד ש-xenografts שמקורם בחולה יכולים לשחזר היבטים רבים של גידולי GBM קליניים והם בעלי ערך עבור מודלים פרה-קליניים18, הם יקרים מטבעם, בעלי תפוקה נמוכה, גוזלים זמן רב, וכרוכים בדאגות אתיות19. תרביות של תאים שמקורם בחולה, על משטחי פלסטיק דו-ממדיים או כספרואידים, נמנעות לרוב מבעיות אלה. בעוד שתאים שמקורם בחולה משמרים סטיות גנטיות, התרביות שלהם בדו-ממד או כספרואידים מרחפים היו במידה רבה ייצוגים גרועים של קסנוגרפטים שמקורם בחולה במכרסמים ובגידולי חולים מקוריים20. בעבר, אנו, ואחרים, הראינו שתאי GBM בתרבית ב-ECM תלת-ממדי המחקה את התכונות המכניות והביוכימיות של רקמת המוח יכולים לשמר פנוטיפים של עמידות לתרופות 10,21,22,23.
אינטראקציות בין חומצה היאלורונית (HA), רב-סוכר הנפוץ ב-ECM במוח וביטוי יתר בגידולי GBM, לבין קולטן ה-CD44 שלה מווסתים את רכישת העמידות לתרופות במבחנה 21,24,25,26,27. לדוגמה, הכללת HA בתוך תרביות תלת-ממדיות רכות הגדילה את היכולת של תאי GBM שמקורם בחולה לרכוש עמידות טיפולית. תגובתיות מכנית זו הייתה תלויה בקשירת HA לקולטני CD44 בתאי GBM21. בנוסף, קשירת אינטגרין לפפטידים נושאי RGD, ששולבו במטריצות תרבית תלת-ממדיות, הגבירה את הכימורסיסטנציה בתיווך CD44 באופן תלוי נוקשות21. מעבר ל-HA, הביטוי של מספר חלבוני ECM, שרבים מהם מכילים אזורי RGD, משתנה בין גידולים רגילים במוח ובגידולי GBM28. לדוגמה, מחקר אחד דיווח כי 28 חלבוני ECM שונים היו מווסתים מוגברת בגידולי GBM29. בתוך מיקרו-סביבה מורכבת זו של מטריצת הגידול, תאים סרטניים משלבים רמזים מכניים וביוכימיים כדי להניב פנוטיפ התנגדות מסוים, התלוי בהבדלים קטנים יחסית (למשל, פחות מסדר גודל) במודולוס של יאנג או בצפיפות של פפטידים קושרי אינטגרין 28,29,30.
הפרוטוקול הנוכחי מאפיין כיצד תאי הגידול מפרשים שילובים ייחודיים של רמזי מטריצה ומזהים מיקרו-סביבה מורכבת וספציפית לחולה, המקדמת עמידות לטיפול (איור 1A). שיטה פוטוכימית ליצירת מטריצות ממוזערות ומכווננות במדויק עבור תרבית תלת-ממדית מספקת מרחב משתנה גדול ואורתוגונלי. מערך שנבנה בהתאמה אישית של נורות LED, המופעל על ידי מיקרו-בקר, שולב בהידרוג’לים של פוטו-קרוסלינק בפורמט לוחית של 384 בארות כדי להגביר את האוטומציה ואת יכולת השכפול. עוצמת החשיפה השתנתה לרוחב היטב כדי לשנות תכונות מיקרו-מכניות של הידרוג’לים שהתקבלו, כפי שהוערך באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM). בעוד שכתב יד זה אינו מתמקד בבניית מערך ההארה עצמו, דיאגרמת מעגלים (איור 1B) ורשימת חלקים (טבלת חומרים) מסופקים ככלי עזר לשעתוק המכשיר.
דו”ח זה מדגים את הדור המהיר של מערך של תאי GBM בתרבית במיקרו-סביבה תלת-ממדית ייחודית, שבה המודולוס של יאנג (ארבע רמות בסדר גודל אחד) ותכולת הפפטידים הקושרים אינטגרין (שמקורם בארבעה חלבוני ECM שונים) היו מגוונים באופן אורתוגונלי. הגישה שימשה אז כדי לחקור את התרומות היחסיות של מכניקת ההידרוג’ל ומעורבות האינטגרין הספציפית ל-ECM על הכדאיות וההתפשטות של תאי GBM שמקורם בחולה כשהם רוכשים עמידות לכימותרפיה של טמוזולומיד (TMZ).
העבודה הנוכחית מציגה שיטות ליצירת תרביות תלת-ממדיות ממוזערות בתוך תרבויות מבוססות HA ובמקביל לשנות את נוקשות המטריצה והפפטידים הזמינים למעורבות באינטגרין. טכניקה זו מאפשרת מחקר שיטתי של האופן שבו פרמטרים של מטריצה משפיעים על פנוטיפים תאיים (למשל, הכדאיות של תאים סרטניים שנחשפו לכימותרפי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות באופן ספציפי לקרולין קים, אמליה לאו, ריאן סטוטמור ואיטאי סולומון על תרומתם לאיטרציות מוקדמות יותר של תוכנית הפוטוגלציה. קווי הסלולר GS122 ו-GS304 סופקו בנדיבות על ידי דייוויד נתנזון. כל הדמויות נוצרו עם BioRender.com. מתקני הליבה של UCLA, המשאבים המשותפים לסינון מולקולרי והמעבדה לאפיון ננו ופיקו סייעו לעבודה. צ’ן צ’יה-צ’ון נתמך על ידי מרכז ההכשרה לרפואה רגנרטיבית ותאי גזע באוניברסיטת UCLA. גריגור ורוז’אניאן נתמך על ידי תוכנית הכשרה לביולוגיה של תאי הגידול מענק NIH (T32 CA 009056).
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |