Il presente protocollo descrive una piattaforma sperimentale per valutare gli effetti dei segnali meccanici e biochimici sulle risposte chemioterapiche delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente in colture 3D matrix-mimetiche utilizzando un dispositivo di illuminazione UV su misura che facilita il fotocrosslinking ad alto rendimento di idrogel con caratteristiche meccaniche sintonizzabili.
Le interazioni cellula-matrice mediano processi fisiologici complessi attraverso segnali biochimici, meccanici e geometrici, influenzando i cambiamenti patologici e le risposte terapeutiche. Si prevede che la contabilizzazione degli effetti della matrice nelle prime fasi della pipeline di sviluppo del farmaco aumenterà la probabilità di successo clinico di nuove terapie. Esistono strategie basate su biomateriali che ricapitolano specifici microambienti tissutali in colture cellulari 3D, ma integrarle con i metodi di coltura 2D utilizzati principalmente per lo screening dei farmaci è stata una sfida. Pertanto, il protocollo qui presentato descrive in dettaglio lo sviluppo di metodi per la coltura 3D all’interno di matrici di biomateriali miniaturizzati in un formato di piastra multi-pozzo per facilitare l’integrazione con le pipeline di screening dei farmaci esistenti e i saggi convenzionali per la vitalità cellulare. Poiché si prevede che le caratteristiche della matrice critiche per la conservazione dei fenotipi clinicamente rilevanti nelle cellule coltivate siano altamente specifiche per i tessuti e la malattia, sarà necessario lo screening combinatorio dei parametri della matrice per identificare le condizioni appropriate per applicazioni specifiche. I metodi qui descritti utilizzano un formato di coltura miniaturizzato per valutare le risposte delle cellule tumorali alla variazione ortogonale della meccanica della matrice e della presentazione del ligando. In particolare, questo studio dimostra l’uso di questa piattaforma per studiare gli effetti dei parametri della matrice sulle risposte delle cellule di glioblastoma derivate dal paziente (GBM) alla chemioterapia.
Il costo previsto per lo sviluppo di un nuovo farmaco è aumentato costantemente negli ultimi dieci anni, con oltre $ 1 miliardo nelle stime attuali1. Parte di questa spesa è l’alto tasso di fallimento dei farmaci che entrano negli studi clinici. Circa il 12% dei farmaci candidati alla fine ottiene l’approvazione dalla Food & Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti (USA) nel 2019. Molti farmaci falliscono nella fase I a causa della tossicità imprevista2, mentre altri che superano gli studi di sicurezza possono fallire a causa della mancanza di efficacia3. Questo logoramento dovuto alla non efficacia può essere in parte spiegato dal fatto che i modelli di cancro utilizzati durante lo sviluppo del farmaco sono notoriamente non predittivi dell’efficacia clinica4.
Le disparità funzionali tra modelli in vitro e in vivo possono essere attribuite alla rimozione delle cellule tumorali dal loro microambiente nativo, comprese le cellule non tumorali e l’ECM fisico 5,6. Comunemente, i gruppi di ricerca utilizzano matrici di coltura disponibili in commercio, come Matrigel (una matrice di membrana basale proteica derivata da sarcomi di topo) per fornire alle cellule tumorali in coltura un microambiente a matrice 3D. Rispetto alla coltura 2D, la coltura 3D nella matrice di membrana ha migliorato la rilevanza clinica dei risultati in vitro 7,8. Tuttavia, i biomateriali di coltura da tessuti decellularizzati, compresa la matrice di membrana, in genere mostrano una variabilità da lotto a lotto che può compromettere la riproducibilità9. Inoltre, le matrici derivate da tumori con origini tissutali diverse da quelle studiate potrebbero non fornire gli opportuni spunti fisiologici10. Infine, i tumori con alti gradi di eterogeneità intratumorale hanno caratteristiche microambientali che variano su una scala di dimensioni submicroniche e che la matrice di membrana non può essere sintonizzata per ricapitolare11.
Il glioblastoma (GBM), un tumore cerebrale uniformemente letale con un tempo di sopravvivenza mediano di circa 15 mesi, è un tumore per il quale lo sviluppo del trattamento è stato particolarmente difficile12,13. L’attuale standard di cura per GBM consiste nella resezione primaria del tumore, seguita dalla radioterapia e quindi dalla chemioterapia con temozolomide (TMZ)14. Tuttavia, più della metà dei tumori GBM clinici mostra resistenza al trattamento attraverso vari meccanismi 15,16,17. Prevedere l’efficacia di un regime di trattamento per un singolo paziente è estremamente difficile. I modelli preclinici standard utilizzati per prevedere i risultati individuali sono costituiti da cellule tumorali derivate dal paziente che si sono deformate ortotopicamente in topi immunocompromessi. Mentre gli xenotrapianti derivati dal paziente possono ricapitolare molti aspetti dei tumori GBM clinici e sono preziosi per i modelli preclinici18, sono intrinsecamente costosi, a bassa produttività, richiedono molto tempo e comportano preoccupazioni etiche19. Le colture di cellule derivate dal paziente, su superfici di plastica 2D o come sferoidi, per lo più evitano questi problemi. Mentre le cellule derivate dal paziente conservano le aberrazioni genetiche, le loro colture in 2D o come sferoidi sospesi sono state in gran parte rappresentazioni scadenti di xenotrapianti derivati dal paziente nei roditori e nei tumori originali dei pazienti20. In precedenza, noi e altri abbiamo dimostrato che le cellule GBM coltivate in un ECM 3D che imita le proprietà meccaniche e biochimiche del tessuto cerebrale possono preservare i fenotipi di resistenza ai farmaci 10,21,22,23.
Le interazioni tra l’acido ialuronico (HA), un polisaccaride abbondante nell’ECM cerebrale e sovraespresso nei tumori GBM, e il suo recettore CD44 modulano l’acquisizione della resistenza ai farmaci in vitro 21,24,25,26,27. Ad esempio, l’inclusione di HA all’interno di colture 3D morbide ha aumentato la capacità delle cellule GBM derivate dal paziente di acquisire resistenza terapeutica. Questa meccano-responsività dipendeva dal legame dell’HA ai recettori CD44 sulle cellule GBM21. Inoltre, il legame dell’integrina ai peptidi portatori di RGD, incorporato in matrici di coltura 3D, ha amplificato la chemioresistenza mediata da CD44 in modo dipendente dalla rigidità21. Oltre all’HA, l’espressione di diverse proteine ECM, molte contenenti regioni RGD, varia tra il cervello normale e i tumori GBM28. Ad esempio, uno studio ha riportato che 28 distinte proteine ECM erano sovraregolate nei tumori GBM29. All’interno di questo complesso microambiente a matrice tumorale, le cellule tumorali integrano segnali meccanici e biochimici per produrre un particolare fenotipo di resistenza, che dipende da differenze relativamente piccole (ad esempio, meno di un ordine di grandezza) nel modulo di Young o densità di peptidi leganti l’integrina 28,29,30.
Il presente protocollo caratterizza il modo in cui le cellule tumorali interpretano combinazioni uniche di segnali matriciali e identificano microambienti a matrice complessi e specifici per il paziente che promuovono la resistenza al trattamento (Figura 1A). Un metodo fotochimico per generare matrici miniaturizzate e sintonizzate con precisione per la coltura 3D fornisce un ampio spazio variabile ortogonale. Un array di LED costruito su misura, gestito da un microcontrollore, è stato incorporato per fotocrosslink idrogel all’interno di un formato di piastra a 384 pozzetti per aumentare l’automazione e la riproducibilità. L’intensità dell’esposizione è stata variata in modo variabile per alterare le proprietà micromeccaniche degli idrogel risultanti, come valutato utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Mentre questo manoscritto non si concentra sulla costruzione dell’array di illuminazione stesso, uno schema elettrico (Figura 1B) e un elenco di parti (Tabella dei materiali) sono forniti come ausili per la riproduzione del dispositivo.
Questo rapporto dimostra la rapida generazione di una serie di cellule GBM coltivate in microambienti 3D unici in cui il modulo di Young (quattro livelli in un singolo ordine di grandezza) e il contenuto peptidico legante l’integrina (derivato da quattro diverse proteine ECM) sono stati variati ortogonalmente. L’approccio è stato poi utilizzato per studiare i contributi relativi della meccanica dell’idrogel e dell’impegno dell’integrina specifica dell’ECM sulla vitalità e la proliferazione delle cellule GBM derivate dal paziente mentre acquisiscono resistenza alla chemioterapia temozolomide (TMZ).
Il lavoro attuale presenta metodi per generare colture miniaturizzate 3D all’interno di HA, alterando contemporaneamente la rigidità della matrice e i peptidi disponibili per l’impegno dell’integrina. Questa tecnica consente lo studio sistematico di come i parametri della matrice influenzano i fenotipi cellulari (ad esempio, la vitalità delle cellule tumorali esposte alla chemioterapia) con una maggiore produttività. Gli approcci precedenti, incluso quello qui presentato, hanno regolato la rigidità dell’idrogel varia…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori vorrebbero ringraziare specificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon per i loro contributi alle precedenti iterazioni dello schema di fotogelazione. Le linee cellulari GS122 e GS304 sono state generosamente fornite da David Nathanson. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. Le strutture principali dell’UCLA, le risorse condivise di screening molecolare e il laboratorio di caratterizzazione nano e pico sono stati fondamentali per il lavoro. Chen Chia-Chun è stato supportato dall’UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan è stato supportato da un tumor cell biology training program NIH Grant (T32 CA 009056).
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |