O presente protocolo descreve uma plataforma experimental para avaliar os efeitos de pistas mecânicas e bioquímicas sobre as respostas quimioterápicas de células glioblastoma derivadas pelo paciente em culturas mímicas de matriz 3D usando um dispositivo de iluminação UV feito sob medida facilitando o fotocrosslinking de alto rendimento de hidrogéis com características mecânicas incompáveis.
As interações entre matriz celular mediam processos fisiológicos complexos por meio de pistas bioquímicas, mecânicas e geométricas, influenciando mudanças patológicas e respostas terapêuticas. Espera-se que a contabilização dos efeitos matriciais no início do pipeline de desenvolvimento de medicamentos aumente a probabilidade de sucesso clínico de novas terapêuticas. Estratégias baseadas em biomateriais recapitulando microambientes específicos de tecido na cultura celular 3D existem, mas integrar-os com os métodos de cultura 2D usados principalmente para a triagem de medicamentos tem sido desafiador. Assim, o protocolo aqui apresentado detalha o desenvolvimento de métodos para a cultura 3D dentro de matrizes biomateriais miniaturizadas em um formato de placa multi-poço para facilitar a integração com os pipelines de triagem de medicamentos existentes e ensaios convencionais para viabilidade celular. Uma vez que a matriz apresenta características críticas para a preservação de fenótipos clinicamente relevantes em células cultivadas, espera-se que seja altamente específico para tecidos e doenças, a triagem combinatória dos parâmetros matriciais será necessária para identificar condições adequadas para aplicações específicas. Os métodos descritos aqui utilizam um formato de cultura miniaturizada para avaliar as respostas das células cancerosas à variação ortogonal da mecânica matricial e apresentação de ligantes. Especificamente, este estudo demonstra o uso desta plataforma para investigar os efeitos dos parâmetros matriciais sobre as respostas das células glioblastoma derivadas do paciente (GBM) à quimioterapia.
O custo esperado para o desenvolvimento de uma nova droga aumentou constantemente na última década, com mais de US $ 1 bilhão em estimativas atuais1. Parte dessa despesa é a alta taxa de falha de medicamentos entrando em ensaios clínicos. Aproximadamente 12% dos candidatos a medicamentos finalmente ganham aprovação da Food & Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos (EUA) em 2019. Muitas drogas falham na Fase I devido à toxicidade inesperada2, enquanto outras que passam por testes de segurança podem falhar devido à falta de eficácia3. Este atrito devido à não eficácia pode ser explicado em parte pelo fato de que os modelos de câncer usados durante o desenvolvimento de medicamentos são notoriamente não preditivos da eficácia clínica4.
Disparidades funcionais entre modelos in vitro e in vivo podem ser atribuídas à remoção de células cancerígenas de seu microambiente nativo, incluindo células não tumorais e o ECM 5,6 físico. Comumente, grupos de pesquisa usam matrizes culturais disponíveis comercialmente, como Matrigel (uma matriz de membrana de porão protéciosa derivada de sarcomas de camundongos) para fornecer células tumorais cultivadas com um microambiente de matriz 3D. Em comparação com a cultura 2D, a cultura 3D na matriz de membrana melhorou a relevância clínica dos resultados in vitro 7,8. No entanto, os biomaterias de cultura de tecidos descelularizados, incluindo a matriz de membrana, normalmente exibem variabilidade em lote que pode comprometer a reprodutibilidade9. Além disso, matrizes derivadas de tumores com diferentes origens teciduais dos estudados podem não fornecer as pistas fisiológicas apropriadas10. Finalmente, os cânceres com altos graus de heterogeneidade intratumoral têm características microambientais que variam em uma escala de tamanho de submicron e que a matriz de membrana não pode ser ajustada para recapitular11.
Glioblastoma (GBM), um tumor cerebral uniformemente letal com um tempo médio de sobrevida de aproximadamente 15 meses, é um câncer para o qual o desenvolvimento do tratamento tem sido particularmente difícil12,13. O padrão atual de cuidado para GBM consiste em ressecção do tumor primário, seguido de radioterapia e quimioterapia usando temozolomide (TMZ)14. No entanto, mais da metade dos tumores clínicos de GBM apresentam resistência ao tratamento através de vários mecanismos 15,16,17. Prever a eficácia de um regime de tratamento para um paciente individual é extremamente difícil. Modelos pré-clínicos padrão usados para prever desfechos individuais consistem em células tumorais derivadas do paciente xenoenxericamente em camundongos imunocomprometidos. Embora os xenoenxertos derivados do paciente possam recapitular muitos aspectos dos tumores clínicos de GBM e são valiosos para modelos pré-clínicos18, eles são inerentemente caros, de baixa produtividade, demorados e envolvem preocupações éticas19. Culturas de células derivadas do paciente, em superfícies plásticas 2D ou como esferoides, evitam principalmente esses problemas. Embora as células derivadas do paciente preservem aberrações genéticas, suas culturas em 2D ou como esferoides suspensos têm sido em grande parte representações ruins de xenoenxertos derivados do paciente em roedores e tumores originaisdo paciente 20. Anteriormente, nós, e outros, mostramos que as células GBM cultivadas em um ECM 3D que imita as propriedades mecânicas e bioquímicas do tecido cerebral podem preservar fenótipos de resistência a drogas 10,21,22,23.
Interações entre o ácido hialurônico (HA), um polissacarídeo abundante no cérebro ECM e superexpresso em tumores GBM, e seu receptor CD44 modulam a aquisição da resistência medicamentosa in vitro 21,24,25,26,27. Por exemplo, a inclusão de HA dentro de culturas 3D suaves aumentou a capacidade das células GBM derivadas do paciente de adquirir resistência terapêutica. Essa mecano-responsividade dependia da vinculação ha aos receptores CD44 em células GBM21. Além disso, a ligação integrin aos peptídeos portadores de RGD, incorporadas em matrizes de cultura 3D, amplificou a chemoresistance mediada pelo CD44 de forma dependente da rigidez21. Além do HA, a expressão de várias proteínas ECM, muitas contendo regiões de RGD, variam entre tumores cerebrais normais e GBM28. Por exemplo, um estudo relatou que 28 proteínas ECM distintas foram regulamentadas em tumores GBM29. Dentro deste complexo microambiente da matriz tumoral, as células cancerígenas integram sinais mecânicos e bioquímicos para produzir um fenótipo de resistência particular, que depende de diferenças relativamente pequenas (por exemplo, menos de uma ordem de magnitude) no modulo de Young ou densidade de peptídeos integrin-binding 28,29,30.
O presente protocolo caracteriza como as células tumorais interpretam combinações únicas de sinais matriciais e identificam microambientes matriciais complexos e específicos do paciente que promovem a resistência ao tratamento (Figura 1A). Um método fotoquímico para gerar matrizes miniaturizadas e precisamente sintonizadas para a cultura 3D proporciona um espaço variável grande e ortogonal. Uma matriz personalizada de LEDs, executado por um microcontrolador, foi incorporada a hidrogéis fotocrosslink dentro de um formato de placa de 384 poços para aumentar a automação e a reprodutibilidade. A intensidade de exposição foi variada em todo o bem para alterar as propriedades micromecânicas dos hidrogéis resultantes, conforme avaliado por meio de microscopia de força atômica (AFM). Embora este manuscrito não se concentre na construção da matriz de iluminação em si, um diagrama de circuito (Figura 1B) e lista de peças (Tabela de Materiais) são fornecidos como auxílios para a reprodução do dispositivo.
Este relatório demonstra a rápida geração de uma matriz de células GBM cultivadas em microambientes 3D únicos nos quais o módulo de Young (quatro níveis em uma única ordem de magnitude) e o teor de peptídeos integrin (derivados de quatro proteínas ECM diferentes) foram variados ortogonicamente. A abordagem foi então utilizada para investigar as contribuições relativas da mecânica hidrogel e do engajamento integrin específico do ECM na viabilidade e proliferação de células GBM derivadas do paciente à medida que adquirem resistência à quimioterapia temozolomide (TMZ).
O trabalho atual apresenta métodos para gerar culturas miniaturizadas em 3D dentro da HA, alterando simultaneamente a rigidez matricial e peptídeos disponíveis para engajamento integrin. Essa técnica permite o estudo sistemático de como os parâmetros matriciais afetam fenótipos celulares (por exemplo, a viabilidade das células cancerígenas expostas à quimioterapia) com aumento do rendimento. Abordagens anteriores, incluindo as aqui apresentadas, têm afinado a rigidez do hidrogel variando a porcentagem de polí…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de reconhecer especificamente Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon por suas contribuições para iterações anteriores do esquema de fotogelação. As linhas de celular GS122 e GS304 foram generosamente fornecidas por David Nathanson. Todas as figuras foram criadas com BioRender.com. As instalações centrais da UCLA, os Recursos Compartilhados de Triagem Molecular e o Laboratório de Caracterização de Nano e Pico foram fundamentais para o trabalho. Chen Chia-Chun foi apoiado pelo UCLA Eli e Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Program. Grigor Varuzhanyan foi apoiado por um programa de treinamento de biologia celular tumoral NIH Grant (T32 CA 009056).
1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
CCK8 | Abcam | ab228554 | |
Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
mLine micropipette | Sartorious | ||
N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
Processing | Processing | 3.5.4 | |
Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
Scoth Tape | |||
Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
Solder Wire | |||
Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |