Гидрогелевые матрицы обеспечивают повышенную пропускную способность для скрининговых эффектов компонентов матрицы и терапии в 3D-моделях опухолей
Summary
Настоящий протокол описывает экспериментальную платформу для оценки влияния механических и биохимических сигналов на химиотерапевтические реакции клеток глиобластомы, полученных от пациента, в 3D матриксно-миметических культурах с использованием специального устройства УФ-освещения, способствующего высокопроизводительному фотосшиванию гидрогелей с настраиваемыми механическими характеристиками.
Abstract
Клеточно-матричные взаимодействия опосредуют сложные физиологические процессы через биохимические, механические и геометрические сигналы, влияя на патологические изменения и терапевтические реакции. Ожидается, что учет матричных эффектов на ранних этапах разработки лекарств увеличит вероятность клинического успеха новых терапевтических средств. Стратегии на основе биоматериалов, повторяющие конкретные микросреды тканей в 3D-культуре клеток, существуют, но интеграция их с методами 2D-культуры, в основном используемыми для скрининга лекарств, была сложной задачей. Таким образом, представленный здесь протокол детализирует разработку методов для 3D-культуры в миниатюрных матрицах биоматериала в формате пластины с несколькими скважинами для облегчения интеграции с существующими трубопроводами скрининга лекарств и обычными анализами жизнеспособности клеток. Поскольку ожидается, что характеристики матрицы, критически важные для сохранения клинически значимых фенотипов в культивируемых клетках, будут высоко ткане- и болезнетворно-специфическими, для выявления соответствующих условий для конкретных применений потребуется комбинаторный скрининг параметров матрицы. Методы, описанные здесь, используют миниатюрный формат культуры для оценки реакций раковых клеток на ортогональную вариацию матричной механики и представления лиганда. В частности, это исследование демонстрирует использование этой платформы для изучения влияния параметров матрицы на реакцию клеток глиобластомы (GBM), полученных от пациента, на химиотерапию.
Introduction
Ожидаемая стоимость разработки нового препарата неуклонно росла в течение последнего десятилетия, и по текущим оценкам 1 млрд. Частью этих расходов является высокий уровень отказов лекарств, поступающих в клинические испытания. Примерно 12% кандидатов на лекарства в конечном итоге получают одобрение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в 2019 году. Многие препараты терпят неудачу в фазе I из-за непредвиденной токсичности2, в то время как другие, которые проходят испытания на безопасность, могут потерпеть неудачу из-за отсутствия эффективности3. Это истощение из-за неэффективности может быть частично объяснено тем фактом, что модели рака, используемые во время разработки лекарств, как известно, не предсказывают клиническую эффективность4.
Функциональные различия между моделями in vitro и in vivo могут быть связаны с удалением раковых клеток из их собственной микросреды, включая неопухолевые клетки и физический ECM 5,6. Как правило, исследовательские группы используют коммерчески доступные матрицы культур, такие как Matrigel (белковая базальная мембранная матрица, полученная из сарком мышей), чтобы обеспечить культивируемые опухолевые клетки микроокружением 3D-матрицы. По сравнению с 2D культурой, 3D культура в мембранной матрице улучшила клиническую значимость результатов in vitro 7,8. Однако культивируемые биоматериалы из децеллюляризованных тканей, включая мембранный матрикс, обычно проявляют вариабельность от партии к партии, что может поставить под угрозу воспроизводимость9. Кроме того, матрицы, полученные из опухолей с различным тканевым происхождением от изученных, могут не обеспечивать соответствующих физиологических сигналов10. Наконец, раковые заболевания с высокой степенью внутриопухолевой гетерогенности имеют микроокружательные особенности, которые варьируются в субмикронной шкале и которые мембранная матрица не может быть настроена на повторение11.
Глиобластома (GBM), равномерно летальная опухоль головного мозга со средним временем выживания около 15 месяцев, является раком, для которого разработка лечения была особенно трудной12,13. Текущий стандарт лечения GBM состоит из первичной резекции опухоли, за которой следует лучевая терапия, а затем химиотерапия с использованием темозоломида (TMZ)14. Тем не менее, более половины клинических опухолей GBM проявляют устойчивость к лечению через различные механизмы 15,16,17. Предсказать эффективность схемы лечения для отдельного пациента крайне сложно. Стандартные доклинические модели, используемые для прогнозирования индивидуальных исходов, состоят из полученных пациентом опухолевых клеток, ксенотрансплантированных ортотопически в мышей с ослабленным иммунитетом. В то время как ксенотрансплантаты, полученные от пациента, могут повторять многие аспекты клинических опухолей GBM и ценны для доклинических моделей18, они по своей сути дороги, имеют низкую пропускную способность, отнимают много времени и связаны с этическими проблемами19. Культуры клеток, полученных от пациента, на 2D-пластиковых поверхностях или в виде сфероидов, в основном избегают этих проблем. В то время как клетки, полученные от пациента, сохраняют генетические аберрации, их культуры в 2D или в виде взвешенных сфероидов были в значительной степени плохими представлениями о ксенотрансплантатах, полученных от пациента, у грызунов и оригинальных опухолей пациента20. Ранее мы и другие показали, что клетки GBM, культивируемые в 3D ECM, который имитирует механические и биохимические свойства ткани мозга, могут сохранять фенотипы лекарственной устойчивости 10,21,22,23.
Взаимодействия между гиалуроновой кислотой (ГК), полисахаридом, распространенным в ECM мозга и чрезмерно экспрессируемым в опухолях GBM, и ее рецептором CD44 модулируют приобретение лекарственной устойчивости in vitro 21,24,25,26,27. Например, включение ГК в мягкие 3D-культуры увеличило способность клеток GBM, полученных от пациента, приобретать терапевтическую резистентность. Эта механочувствительность зависела от связывания ГК с рецепторами CD44 на клетках GBM21. Кроме того, связывание интегрина с RGD-несущими пептидами, включенными в матрицы 3D-культур, усиливало CD44-опосредованное хеморезистентность в зависимости от жесткости21. Помимо ГК, экспрессия нескольких белков ECM, многие из которых содержат области RGD, варьируется между нормальным мозгом и опухолями GBM28. Например, в одном исследовании сообщалось, что 28 различных белков ECM были повышены в опухолях GBM29. В этом сложном микроокружении опухолевой матрицы раковые клетки интегрируют механические и биохимические сигналы, чтобы получить определенный фенотип резистентности, который зависит от относительно небольших различий (например, менее порядка величины) в модуле Юнга или плотности интегрин-связывающих пептидов 28,29,30.
Настоящий протокол характеризует, как опухолевые клетки интерпретируют уникальные комбинации матричных сигналов и идентифицируют сложные, специфические для пациента матричные микросреды, которые способствуют резистентности к лечению (рисунок 1A). Фотохимический метод генерации миниатюрных, точно настроенных матриц для 3D-культуры обеспечивает большое ортогональное переменное пространство. Специально изготовленный массив светодиодов, управляемый микроконтроллером, был включен в гидрогели фотосшивания в формате пластины с 384 лунками для повышения автоматизации и воспроизводимости. Интенсивность воздействия варьировалась в зависимости от скважины, чтобы изменить микромеханические свойства полученных гидрогелей, как оценивалось с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM). Хотя эта рукопись не фокусируется на построении самого массива освещения, принципиальная схема (рисунок 1B) и список деталей (таблица материалов) предоставляются в качестве вспомогательных средств для воспроизведения устройства.
Этот отчет демонстрирует быструю генерацию массива клеток GBM, культивируемых в уникальных 3D-микросредах, в которых модуль Юнга (четыре уровня на одном порядке) и содержание интегрин-связывающих пептидов (полученных из четырех различных белков ECM) варьировались ортогонально. Затем этот подход был использован для исследования относительного вклада механики гидрогеля и взаимодействия интегрина с ECM-специфической для жизнеспособности и пролиферации клеток GBM, полученных от пациента, когда они приобретают устойчивость к химиотерапии темозоломидом (TMZ).
Protocol
Representative Results
Discussion
В текущей работе представлены методы генерации 3D,миниатюрных культур на основе ГК, одновременно изменяя жесткость матрицы и пептиды, доступные для взаимодействия с интегрином. Этот метод позволяет систематически изучать, как параметры матрицы влияют на клеточные фенотипы (например, ж…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы особо поблагодарить Кэролин Ким, Амелию Лао, Райана Стаутамора и Итая Соломона за их вклад в более ранние итерации схемы фотогелирования. Сотовые линии GS122 и GS304 были щедро предоставлены Дэвидом Натансоном. Все фигуры были созданы с BioRender.com. Основные объекты UCLA, общие ресурсы молекулярного скрининга и лаборатория характеристик nano и pico сыграли важную роль в работе. Чэнь Чиа-Чун был поддержан Ucla Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Григора Варужаняна поддержал грант NIH По программе обучения биологии опухолевых клеток (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
Riferimenti
- Scannell, J. W., Blanckley, A., Boldon, H., Warrington, B. Diagnosing the decline in pharmaceutical R&D efficiency. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (3), 191-200 (2012).
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khozin, S., Liu, K., Jarow, J. P., Pazdur, R. Why do oncology drugs fail to gain US regulatory approval. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 450-451 (2015).
- Booth, B., Ma, P., Glassman, R. Oncology’s trials. Market indicators. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 609-610 (2003).
- Da Ros, M., et al. Glioblastoma chemoresistance: The double play by microenvironment and blood-brain barrier. International Journal of Molecular Sciences. 19 (10), 2879 (2018).
- Broekman, M. L., et al. Multidimensional communication in the microenvirons of glioblastoma. Nature Reviews Neurology. 14 (8), 482-495 (2018).
- Grundy, T. J., et al. Differential response of patient-derived primary glioblastoma cells to environmental stiffness. Scientific Reports. 6 (1), 1-10 (2016).
- Gomez-Roman, N., Stevenson, K., Gilmour, L., Hamilton, G., Chalmers, A. J. A novel 3D human glioblastoma cell culture system for modeling drug and radiation responses. Neuro-Oncology. 19 (2), 229-241 (2017).
- Simoni, R. D., et al. Basement membrane complexes with biological activity. Biochimica. 25 (2), 312-318 (2002).
- Xiao, W., et al. Brain-mimetic 3D culture platforms allow investigation of cooperative effects of extracellular matrix features on therapeutic resistance in glioblastoma. Ricerca sul cancro. 78 (5), 1358-1370 (2018).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
- Spinelli, C., et al. Molecular subtypes and differentiation programmes of glioma stem cells as determinants of extracellular vesicle profiles and endothelial cell-stimulating activities. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1490144 (2018).
- Ostrom, Q. T., Cioffi, G., Waite, K., Kruchko, C., Barnholtz-Sloan, J. S. CBTRUS statistical report: Primary brain and other central nervous system tumors diagnosed in the United States in 2014-2018. Neuro-Oncology. 23, (2021).
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
- Brennan, C. W., et al. The somatic genomic landscape of glioblastoma. Cell. 155 (2), 462-477 (2013).
- Tomczak, K., Czerwińska, P., Wiznerowicz, M. The Cancer Genome Atlas (TCGA): An immeasurable source of knowledge. Contemporary oncology. 19, 68-77 (2015).
- Lee, S. Y. Temozolomide resistance in glioblastoma multiforme. Genes and Diseases. 3 (3), 198-210 (2016).
- Joo, K. M., et al. Patient-specific orthotopic glioblastoma xenograft models recapitulate the histopathology and biology of human glioblastomas in situ. Cell Reports. 3 (1), 260-273 (2013).
- Levy, N. The use of animal as models: Ethical considerations. International Journal of Stroke. 7 (5), 440-442 (2012).
- Phon, B. W. S., Kamarudin, M. N. A., Bhuvanendran, S., Radhakrishnan, A. K. Transitioning preclinical glioblastoma models to clinical settings with biomarkers identified in 3D cell-based models: A systematic scoping review. Biomedicine & Pharmacotherapy. 145, 112396 (2022).
- Xiao, W., et al. Bioengineered scaffolds for 3D culture demonstrate extracellular matrix-mediated mechanisms of chemotherapy resistance in glioblastoma. Matrix Biology. 85-86, 128-146 (2020).
- Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744 (2020).
- Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology Advances. 32 (7), 1256-1268 (2014).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived Glioblastoma Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Preston, M. Digestion products of the PH20 hyaluronidase inhibit remyelination. Annals of Neurology. 73 (2), 266-280 (2013).
- Kim, Y., Kumar, S. CD44-mediated adhesion to hyaluronic acid contributes to mechanosensing and invasive motility. Molecular Cancer Research. 12 (10), 1416-1429 (2014).
- Pibuel, M. A., Poodts, D., Díaz, M., Hajos, S. E., Lompardía, S. L. The scrambled story between hyaluronan and glioblastoma. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100549 (2021).
- Xiao, W., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Integrating the glioblastoma microenvironment into engineered experimental models. Future Science OA. 3 (3), (2017).
- Trombetta-Lima, M., et al. Extracellular matrix proteome remodeling in human glioblastoma and medulloblastoma. Journal of Proteome Research. 20 (10), 4693-4707 (2021).
- Schregel, K., et al. Characterization of glioblastoma in an orthotopic mouse model with magnetic resonance elastography. NMR in Biomedicine. 31 (10), 3840 (2018).
- Xiao, W., Ehsanipour, A., Sohrabi, A., Seidlits, S. K. Hyaluronic-acid based hydrogels for 3-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e58176 (2018).
- Guz, N., Dokukin, M., Kalaparthi, V., Sokolov, I. If cell mechanics can be described by elastic modulus: Study of different models and probes used in indentation experiments. Biophysical Journal. 107 (3), 564-575 (2014).
- Sneddon, I. N. The relation between load and penetration in the axisymmetric boussinesq problem for a punch of arbitrary profile. International Journal of Engineering Science. 3 (1), 47-57 (1965).
- Soofi, S. S., Last, J. A., Liliensiek, S. J., Nealey, P. F., Murphy, C. J. The elastic modulus of MatrigelTM as determined by atomic force microscopy. Journal of Structural Biology. 167 (3), 216-219 (2009).
- Mayerhöfer, T. G., Popp, J. Beer’s law – Why absorbance depends (almost) linearly on concentration. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 20 (4), 511-515 (2019).
- Puth, M. T., Neuhäuser, M., Ruxton, G. D. On the variety of methods for calculating confidence intervals by bootstrapping. Journal of Animal Ecology. 84 (4), 892-897 (2015).
- Lavrentieva, A. Gradient hydrogels. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 178, 227-251 (2020).
- Zhu, D., Trinh, P., Li, J., Grant, G. A., Yang, F. Gradient hydrogels for screening stiffness effects on patient-derived glioblastoma xenograft cellfates in 3D. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 109 (6), 1027-1035 (2021).
- da Hora, C. C., Schweiger, M. W., Wurdinger, T., Tannous, B. A. Patient-derived glioma models: From patients to dish to animals. Cells. 8 (10), 1177 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Molecular Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Scaringi, C., Minniti, G., Caporello, P., Enrici, R. M. Integrin inhibitor cilengitide for the treatment of glioblastoma: A brief overview of current clinical results. Anticancer Research. 32 (10), 4213-4224 (2012).
