Las matrices de hidrogel permiten un mayor rendimiento para los efectos de detección de los componentes de la matriz y la terapéutica en modelos tumorales 3D
Summary
El presente protocolo describe una plataforma experimental para evaluar los efectos de las señales mecánicas y bioquímicas en las respuestas quimioterapéuticas de las células de glioblastoma derivadas de pacientes en cultivos miméticos de matriz 3D utilizando un dispositivo de iluminación UV hecho a medida que facilita la fotoreticulación de alto rendimiento de hidrogeles con características mecánicas sintonizables.
Abstract
Las interacciones célula-matriz median procesos fisiológicos complejos a través de señales bioquímicas, mecánicas y geométricas, influyendo en los cambios patológicos y las respuestas terapéuticas. Se espera que la contabilidad de los efectos de la matriz más temprano en la cartera de desarrollo de fármacos aumente la probabilidad de éxito clínico de las nuevas terapias. Existen estrategias basadas en biomateriales que recapitulan microambientes tisulares específicos en cultivos celulares 3D, pero la integración de estos con los métodos de cultivo 2D utilizados principalmente para la detección de fármacos ha sido un desafío. Por lo tanto, el protocolo presentado aquí detalla el desarrollo de métodos para el cultivo 3D dentro de matrices de biomateriales miniaturizados en un formato de placa de múltiples pocillos para facilitar la integración con las tuberías de detección de fármacos existentes y los ensayos convencionales para la viabilidad celular. Dado que se espera que las características de la matriz críticas para preservar fenotipos clínicamente relevantes en células cultivadas sean altamente específicas de tejidos y enfermedades, será necesario un cribado combinatorio de los parámetros de la matriz para identificar las condiciones apropiadas para aplicaciones específicas. Los métodos descritos aquí utilizan un formato de cultivo miniaturizado para evaluar las respuestas de las células cancerosas a la variación ortogonal de la mecánica de la matriz y la presentación del ligando. Específicamente, este estudio demuestra el uso de esta plataforma para investigar los efectos de los parámetros de la matriz en las respuestas de las células de glioblastoma derivado del paciente (GBM) a la quimioterapia.
Introduction
El costo esperado de desarrollar un nuevo medicamento ha aumentado constantemente en la última década, con más de $ 1 mil millones en estimaciones actuales1. Parte de este gasto es la alta tasa de fracaso de los medicamentos que ingresan a los ensayos clínicos. Aproximadamente el 12% de los candidatos a medicamentos finalmente obtienen la aprobación de la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de los Estados Unidos (EE. UU.) en 2019. Muchos medicamentos fallan en la Fase I debido a toxicidad imprevista2, mientras que otros que pasan los ensayos de seguridad pueden fallar debido a la falta de eficacia3. Este desgaste debido a la falta de eficacia puede explicarse en parte por el hecho de que los modelos de cáncer utilizados durante el desarrollo de fármacos son notoriamente no predictivos de la eficacia clínica4.
Las disparidades funcionales entre los modelos in vitro e in vivo pueden atribuirse a la eliminación de células cancerosas de su microambiente nativo, incluidas las células no tumorales y la ECM física 5,6. Comúnmente, los grupos de investigación utilizan matrices de cultivo disponibles comercialmente, como Matrigel (una matriz proteica de membrana basal derivada de sarcomas de ratón) para proporcionar a las células tumorales cultivadas un microambiente de matriz 3D. En comparación con el cultivo 2D, el cultivo 3D en matriz de membrana ha mejorado la relevancia clínica de los resultados in vitro 7,8. Sin embargo, los biomateriales de cultivo de tejidos descelularizados, incluida la matriz de membrana, generalmente exhiben variabilidad de lote a lote que puede comprometer la reproducibilidad9. Además, las matrices derivadas de tumores con orígenes tisulares diferentes a los estudiados pueden no proporcionar las señales fisiológicas adecuadas10. Finalmente, los cánceres con altos grados de heterogeneidad intratumoral tienen características microambientales que varían en una escala de tamaño submicrométrico y que la matriz de membrana no se puede ajustar para recapitular11.
El glioblastoma (GBM), un tumor cerebral uniformemente letal con una mediana de supervivencia de aproximadamente 15 meses, es un cáncer para el que el desarrollo del tratamiento ha sido particularmente difícil12,13. El estándar de atención actual para la GBM consiste en la resección primaria del tumor, seguida de radioterapia y luego quimioterapia con temozolomida (TMZ)14. Sin embargo, más de la mitad de los tumores clínicos de GBM exhiben resistencia al tratamiento a través de diversos mecanismos 15,16,17. Predecir la eficacia de un régimen de tratamiento para un paciente individual es extremadamente difícil. Los modelos preclínicos estándar utilizados para predecir los resultados individuales consisten en células tumorales derivadas del paciente xenoinjertadas ortotópicamente en ratones inmunocomprometidos. Si bien los xenoinjertos derivados del paciente pueden recapitular muchos aspectos de los tumores clínicos de GBM y son valiosos para los modelos preclínicos18, son intrínsecamente caros, de bajo rendimiento, requieren mucho tiempo e involucran preocupaciones éticas19. Los cultivos de células derivadas del paciente, en superficies plásticas 2D o como esferoides, evitan en su mayoría estos problemas. Si bien las células derivadas de pacientes conservan aberraciones genéticas, sus cultivos en 2D o como esferoides suspendidos han sido en gran medida representaciones pobres de xenoinjertos derivados de pacientes en roedores y tumores de pacientes originales20. Anteriormente, nosotros, y otros, hemos demostrado que las células GBM cultivadas en un ECM 3D que imita las propiedades mecánicas y bioquímicas del tejido cerebral pueden preservar los fenotipos de resistencia a los medicamentos 10,21,22,23.
Las interacciones entre el ácido hialurónico (HA), un polisacárido abundante en la ECM cerebral y sobreexpresado en los tumores GBM, y su receptor CD44 modulan la adquisición de resistencia a los fármacos in vitro 21,24,25,26,27. Por ejemplo, la inclusión de HA dentro de cultivos blandos en 3D aumentó la capacidad de las células GBM derivadas del paciente para adquirir resistencia terapéutica. Esta mecano-responsividad dependía de la unión de HA a los receptores CD44 en las células GBM21. Además, la unión de la integrina a péptidos portadores de RGD, incorporada a matrices de cultivo 3D, amplificó la quimiorresistencia mediada por CD44 de una manera dependiente de la rigidez21. Más allá de HA, la expresión de varias proteínas ECM, muchas de las cuales contienen regiones RGD, varían entre los tumores cerebrales normales y GBM28. Por ejemplo, un estudio informó que 28 proteínas ECM distintas estaban reguladas al alza en los tumores GBM29. Dentro de este complejo microambiente de matriz tumoral, las células cancerosas integran señales mecánicas y bioquímicas para producir un fenotipo de resistencia particular, que depende de diferencias relativamente pequeñas (por ejemplo, menos de un orden de magnitud) en el módulo de Young o la densidad de los péptidos de unión a la integrina 28,29,30.
El presente protocolo caracteriza cómo las células tumorales interpretan combinaciones únicas de señales de matriz e identifican microambientes de matriz complejos y específicos del paciente que promueven la resistencia al tratamiento (Figura 1A). Un método fotoquímico para generar matrices miniaturizadas y ajustadas con precisión para el cultivo 3D proporciona un gran espacio variable ortogonal. Se incorporó una matriz personalizada de LED, ejecutada por un microcontrolador, a los hidrogeles de enlace fotocrucedor dentro de un formato de placa de 384 pocillos para aumentar la automatización y la reproducibilidad. La intensidad de la exposición varió entre los pozos para alterar las propiedades micromecánicas de los hidrogeles resultantes, según se evaluó mediante microscopía de fuerza atómica (AFM). Si bien este manuscrito no se centra en la construcción de la matriz de iluminación en sí, se proporcionan un diagrama de circuito (Figura 1B) y una lista de piezas (Tabla de materiales) como ayudas para la reproducción del dispositivo.
Este informe demuestra la rápida generación de una serie de células GBM cultivadas en microambientes 3D únicos en los que el módulo de Young (cuatro niveles en un solo orden de magnitud) y el contenido de péptidos de unión a integrina (derivado de cuatro proteínas ECM diferentes) se variaron ortogonalmente. El enfoque se utilizó para investigar las contribuciones relativas de la mecánica del hidrogel y el compromiso de la integrina específica de ECM en la viabilidad y proliferación de las células GBM derivadas del paciente a medida que adquieren resistencia a la quimioterapia con temozolomida (TMZ).
Protocol
Representative Results
Discussion
El trabajo actual presenta métodos para generar cultivos miniaturizados en 3D dentro de ha basados en HA, al tiempo que altera la rigidez de la matriz y los péptidos disponibles para el compromiso con la integrina. Esta técnica permite el estudio sistemático de cómo los parámetros de la matriz afectan a los fenotipos celulares (por ejemplo, la viabilidad de las células cancerosas expuestas a la quimioterapia) con un mayor rendimiento. Los enfoques anteriores, incluido el presentado en este documento, han ajustado …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A los autores les gustaría agradecer específicamente a Carolyn Kim, Amelia Lao, Ryan Stoutamore e Itay Solomon por sus contribuciones a iteraciones anteriores del esquema de fotogelación. Las líneas celulares GS122 y GS304 fueron generosamente proporcionadas por David Nathanson. Todas las figuras fueron creadas con BioRender.com. Las instalaciones centrales de UCLA, los Recursos Compartidos de Detección Molecular y el Laboratorio de Caracterización Nano y Pico fueron fundamentales para el trabajo. Chen Chia-Chun fue apoyado por el UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Training Program. Grigor Varuzhanyan fue apoyado por una subvención del Programa de Capacitación en Biología celular tumoral de los NIH (T32 CA 009056).
Materials
| 1.1 kOhm resistors, 6 W | Digikey | 35601k1ft | |
| 1.7 mL microcentrifuge tube | Genesse Scientific | 21-108 | |
| 15 mL conical tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 365 nm LED | Digikey | ltpl-c034uvh365 | |
| 384 well plate | Bio Greiner One | 781090 | |
| 40 µm cell strainer | MTC bio | C4040 | |
| 4-Armed thiol terminated polyethlene glycol (20 kDa) | Laysan Bio | 4arm-PEG-SH-20K-1g | |
| 6 NPN BJTs | Digikey | 2n5550ta | |
| 80 Ohm resistors, 0.125 W | Digikey | erjj-6enf80r6v | |
| 8-Armed norbornene terminated polyethylene glycol (20 kDa) | Jenkem Technology | A7025-1 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104500 | cell dissociation reagent |
| AFM Probes | Novascan | 0.01 N/m Nominal spring constant, 2.5 µm SiO2 particle | |
| Arduino IDE | Arduino | 1.8.19 | |
| Arduino Nano | Makerfire | Mini Nano V3.0 ATmega328P Microcontroller Board | |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/mL |
| CCK8 | Abcam | ab228554 | |
| Centrifuge | Thermoscientific | sorvall legend xtr | |
| CP100ST | Gilson | F148415 | Pipette tips for positive displacement pipette |
| Cubis Semi-Micro Balance | Sartorius | MSA225S100DI | |
| DMEM – F12 (50-50) | Life Technologies | 11330057 | 1x |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| DPBS Ca (-) Mg (-) | Genesse Scientific | 25-508 | |
| EGF | Peprotech | AF100-15 | 50 ng/mL |
| Ethanol, Anhydrous | Fisher Scientific | A405P | Add DI water to dilute to 70% |
| Fisherbrand Class B Amber Glass threaded vials | Fisher Scientific | 03-339-23C | |
| Fisherbrand Weighing Paper | Fisher Scientific | 09-898-12B | |
| G21 Supplement | Gemini Bio | 400-160 | 50x |
| Hanks Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14175095 | |
| HCl, ACS, 12M | Sigma Aldrich | S25838A | Add DI water to dilute to 1 M |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma Aldrich | H3149-100Ku | 25 µg/mL |
| HEPES | Sigma Aldrich | H7006-100G | |
| Hot Air Gun | Wagner | HT1000 | |
| Integrin-binding sialoprotein (IBSP) peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGGGGNGEPRGDTYRAY |
| Lithium phenyl-2,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) , >95% | Sigma Aldrich | 900889-1G | |
| Magnetic stir plate | Thermo Scientific | SP194715 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall legend micro 21R | |
| Microman E single Channel Pipettor | Gilson | FD10004 | Positive displacement pipette |
| Micropipette Tips | Various Manufacturs | Various sizes | |
| mLine micropipette | Sartorious | ||
| N-acetyl Cysteine | Sigma Aldrich | A7250-10G | |
| Nanowizard 4 | Bruker | AFM microscope | |
| NaOH | Fisher Scientific | ss255-1 | Add DI water to dilute to 1 M |
| Normoicin | Invivogen | ant-nr-1 | 500x |
| Osteopontin Peptide | Genscript | Custom Order | GCGYGTVDVPDGRGDSLAYG |
| Pipet Aid | Drummond | 4000102 | |
| Plain Microscope Slides | Globe Scientific | 1301 | |
| Press-To-Seal silicone Isolator, 12-4.5mm diam x 2mm deep | Grace Bio Labs | 664201-A | Cut so that 8 individual molds are made from a single sheet |
| Processing | Processing | 3.5.4 | |
| Repeater M4 | Eppendorf | 4982000322 | |
| Repeater Pipette Tips | Sartorious | 30089430 | 1 mL sizes |
| RGD Peptide | Genscript | GCGYGRGDSPG | |
| Scoth Tape | |||
| Serological Pipettes | Genesse Scientific | 12-102,12-104 | 5,10 mL Pipettes |
| Solder Paste | Digikey | 315-NC191LT15T5-ND | |
| Solder Wire | |||
| Straight dissecting forceps | VWR Scientific | 82027-408 | |
| Synergy H1 Plate Reader | Biotek | ||
| T-75 Cell Culture Treated Flask | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Temozolomide | Sigma Aldrich | T2577 | Typically used from 10 µM to 100 µM |
| Tenascin-C Peptide | Genscript | GCGYGRSTDLPGLKAATHYTITIR GV |
|
| Thiolated Hyaluronic Acid (700 kDa), 6-8% modified | Lifecore Biomedical | HA700K5 | |
| VWR Spinbar, Flea Micro | VWR | 58948-375 |
Riferimenti
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