Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Bridget T. Jacques-Fricke; Julaine Roffers-Agarwal; Callie M. Gustafson; Laura S. Gammill

doi:10.3791/63799

JoVE Journal > Developmental Biology

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Biologia dello sviluppo

चिक कपाल तंत्रिका शिखा सेल संस्कृतियों की तैयारी और रूपात्मक विश्लेषण

Published: June 27, 2022

doi:

10.3791/63799

Bridget T. Jacques-Fricke, Julaine Roffers-Agarwal³, Callie M. Gustafson³, Laura S. Gammill³

¹Department of Biology and Neuroscience Program,Hamline University, ²Department of Genetics, Cell Biology and Development,University of Minnesota, ³Developmental Biology Center,University of Minnesota

Summary

यह बहुमुखी प्रोटोकॉल चूजा भ्रूण से कपाल तंत्रिका सिलवटों के छांटना के माध्यम से प्रीमाइग्रेटरी तंत्रिका शिखा कोशिकाओं (एनसीसी) के अलगाव का वर्णन करता है। चढ़ाना और इनक्यूबेशन पर, प्रवासी एनसीसी तंत्रिका गुना एक्सप्लांट्स से उभरते हैं, जिससे सरलीकृत 2 डी वातावरण में सेल आकृति विज्ञान और प्रवास के आकलन की अनुमति मिलती है।

Abstract

कशेरुक विकास के दौरान, तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) बड़े पैमाने पर पलायन करती हैं और विभिन्न कोशिका प्रकारों में अंतर करती हैं जो क्रानियोफेशियल कंकाल और परिधीय तंत्रिका तंत्र जैसी संरचनाओं में योगदान करती हैं। जबकि 3 डी भ्रूण के संदर्भ में एनसीसी माइग्रेशन को समझना महत्वपूर्ण है, 2 डी संस्कृति में प्रवासी कोशिकाओं को अलग करना भ्रूण के अध्ययन के पूरक, दृश्य और कार्यात्मक लक्षण वर्णन की सुविधा प्रदान करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल प्राथमिक एनसीसी संस्कृतियों को उत्पन्न करने के लिए चिक कपाल तंत्रिका सिलवटों को अलग करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करता है। प्रवासी एनसीसी एक फाइब्रोनेक्टिन-लेपित सब्सट्रेट पर चढ़ाया गया तंत्रिका गुना एक्सप्लांट्स से निकलते हैं। इसके परिणामस्वरूप छितरे हुए, अनुयायी एनसीसी आबादी होती है जिसका आकलन धुंधला और मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण द्वारा किया जा सकता है। यह सरलीकृत संस्कृति दृष्टिकोण अत्यधिक अनुकूलनीय है और इसे अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, एनसीसी उत्प्रवास और प्रवासी व्यवहार का मूल्यांकन समय-चूक इमेजिंग द्वारा किया जा सकता है या जीन अभिव्यक्ति (जैसे, डीएनए, मॉर्फोलिनो, या सीआरआईएसपीआर इलेक्ट्रोपोरेशन) के अवरोधकों या प्रयोगात्मक जोड़तोड़ को शामिल करके कार्यात्मक रूप से पूछताछ की जा सकती है। इसकी बहुमुखी प्रतिभा के कारण, यह विधि कपाल एनसीसी विकास की जांच के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करती है।

Introduction

तंत्रिका शिखा कोशिकाएं (एनसीसी) कशेरुक भ्रूण में एक क्षणिक कोशिका आबादी हैं। एनसीसी तंत्रिका प्लेट की सीमाओं पर निर्दिष्ट किए जाते हैं और पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब^{से पलायन} करने के लिए एक उपकला-से-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरते हैं 1. ईएमटी के बाद, एनसीसी पूरे भ्रूण में बड़े पैमाने पर फैलते हैं, अंततः विभिन्न संरचनाओं में अंतर और योगदान देते हैं, जिसमें क्रैनियोफेशियल कंकाल, हृदय का बहिर्वाह पथ और परिधीय तंत्रिका तंत्र का बहुमत^{शामिल है}। सेल ध्रुवीयता, साइटोस्केलेटन और आसंजन गुणों में परिवर्तन एक प्रीमाइग्रेटरी से प्रवासी सेल आबादी में इस बदलाव को रेखांकित करता है³. एनसीसी ईएमटी और माइग्रेशन का अध्ययन सेल गतिशीलता के मौलिक तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और जन्म दोषों और कैंसर मेटास्टेसिस को रोकने और इलाज के प्रयासों को सूचित करता है।

जबकि विवो विश्लेषण भ्रूण के संदर्भ में एनसीसी विकास प्रक्रियाओं को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, इन विट्रो विधियां दृश्य और भौतिक पहुंच प्रदान करती हैं जो अतिरिक्त प्रयोगात्मक मार्गों की सुविधा प्रदान करती हैं। एक सरलीकृत 2 डी वातावरण में, एनसीसी आकृति विज्ञान, साइटोस्केलेटल संरचनाएं और पलायन की दूरी का मूल्यांकन किया जा सकता है। इसके अलावा, गतिशील एनसीसी के प्रवासी व्यवहार पर आनुवंशिक या घुलनशील कारक गड़बड़ी के प्रभावों का विश्लेषण 4,5,6,7,8,9,10 किया जा सकता है। इसके अलावा, पृथक प्रीमिग्रेटरी या प्रवासी एनसीसी को प्रोटिओमिक, ट्रांसक्रिप्टोमिक और एपिजेनोमिक प्रोफाइलिंग ^7,11 के माध्यम से एनसीसी के विकासात्मक विनियमन का अध्ययन करने के लिए उच्च-थ्रूपुट पद्धतियों के लिए एकत्र, पूल और उपयोग किया जा सकता ^है। जबकि विभिन्न विकासात्मक मॉडल जीवों ^12,13,14 से कपाल एनसीसी तैयार करने के तरीके उपलब्ध हैं, यह लेख उन लोगों के लिए दृष्टिकोण के यांत्रिकी को प्रदर्शित करता है जो पहले चिकी भ्रूण से कपाल एनसीसी संस्कृति सीखते हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल लड़की कपाल एनसीसी संस्कृतियों (चित्रा 1) तैयार करने के लिए एक बहुमुखी तकनीक का वर्णन करता है। क्योंकि एनसीसी एक संस्कृति सब्सट्रेट पर प्रत्यारोपित तंत्रिका सिलवटों से आसानी से पलायन करते हैं, चूजा एनसीसी स्वाभाविक रूप से भ्रूण के ऊतकों से अलग हो जाते हैं, और प्राथमिक संस्कृतियां आसानी से उत्पन्न होती हैं। जैसा कि मिडब्रेन एनसीसी कपाल तंत्रिका सिलवटों (ट्रंक¹⁵ में लंबे, सेल-बाय-सेल डेलेमिनेशन के विपरीत) से बड़े पैमाने पर पलायन करते हैं, इन संस्कृतियों में मुख्य रूप से प्रवासी कपाल तंत्रिका शिखा कोशिकाएं होती हैं, प्रारंभिक तंत्रिका गुना छांटना प्रीमाइग्रेटरी एनसीसी के लिए एक संग्रह विधि प्रदान करता है। चिक कपाल तंत्रिका सिलवटों को विच्छेदन और संवर्धन के लिए एक बुनियादी विधि विस्तृत है, और इस विधि पर विभिन्न अनुप्रयोगों और विविधताओं के लिए सुझाव दिए जाते हैं।

चित्रा 1: लड़की कपाल तंत्रिका गुना संस्कृति प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध अवलोकन (ए, बी) कपाल तंत्रिका सिलवटों (नीले रंग में उल्लिखित) पांच सोमाइट्स (ए में पृष्ठीय दृश्य में दिखाया गया है) के साथ एक लड़की भ्रूण से उत्पादित कर रहे हैं। ग्रे बैंड, कार्डियक अर्धचंद्र। (सी) जब फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया जाता है, तो प्रवासी तंत्रिका शिखा कोशिकाएं तंत्रिका सिलवटों से निकलती हैं और सब्सट्रेट पर फैल जाती हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Protocol

गैलस गैलस नस्लों की किसी भी किस्म का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें व्हाइट लेगहॉर्न, गोल्डन सेक्स लिंक या रोड आइलैंड रेड शामिल हैं। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले चिकन अंडे विभिन्न नस्लों के ?…

Representative Results

वर्तमान प्रोटोकॉल का अवलोकन चित्रा 1 में दिखाया गया है। इनक्यूबेटेड अंडे खोले गए थे, और जर्दी, सतह पर भ्रूण के साथ, धीरे-धीरे एक दस्ताने वाले हाथ (चित्रा 2 ए, बी) की हथेली में डा?…

Discussion

यहां वर्णित तकनीक चिक तंत्रिका सिलवटों को अलग करने और प्रवासी कपाल एनसीसी की संस्कृतियों को बनाने के लिए उन्हें चढ़ाने की एक अनुकूलनीय विधि प्रदान करती है। ये संस्कृतियां चूजा एनसीसी माइग्रेशन और आक…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम कोरिन ए फेयरचाइल्ड और केटी एल वर्मिलियन को धन्यवाद देते हैं, जिन्होंने चिक कपाल तंत्रिका गुना संस्कृति प्रोटोकॉल के हमारे संस्करण को विकसित करने में भाग लिया।

Materials

AxioObserver equipped with an LSM710 confocal scan head controlled by ZEN 3.0 SR software	Zeiss		Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C3306
Chamber dishes (glass bottom, single or divided)	MatTek; Cell Vis	P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)	Single chamber 35 mm or 4 chamber 35 mm
Cover glass	Carolina Biological Supply Company	633029, 633031, 633033, 633035, 633037	circles, 0.13–0.17 mm thickness, available in 12-25 mm diameter
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033	Alternative for L15 media
Egg incubator	Sportsman	1502
FBS	Life Technologies	10437-028
Fibronectin	Fisher Scientific	CB-40008A
Filter paper	Whatman		grade 3MM chromatography
Forceps (blunt)	Fisher Scientific; Thomas Scientific	08-890 (Fisher);1141W97 (Thomas)
Forceps (fine)	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
Image J	https://fiji.sc/		Free image analysis software
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P0662
L15 media	Invitrogen	11415064
L-glutamine	Invitrogen	25030
Mounting Media (Vectashield or ProLong Gold)	Vector Laboratories; Thermofisher Scientific	H-1700 (Vectashield); P36930 (ProLong Gold)
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S9638
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140-148	10,000 Units/mL Penicillin; 10,000 mg/mL Streptomycin
Petri Dishes	VWR (or similar)		60 mm, 100 mm
Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951	multiple flurophores available
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12	For tungsten needle (alternative for spring scissors)
Scissors (dissection)	Fine Science Tools	14061-10
Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-08	2.5 mm cutting edge (alternative for tungsten needle)
Sylgard	Krayden	Sylgard 184
Syringe Filters	Sigma-Aldrich	SLGVM33RS	Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 µm, PVDF, 33 mm, gamma sterilized
Tissue culture dishes	Sarstedt	83-3900	35 mm culture dishes for bulk neural fold cultures
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Tungsten wire	Variety of sources		0.01" diameter for tungsten needle (alternative for spring scissors)

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Jacques-Fricke, B. T., Roffers-Agarwal, J., Gustafson, C. M., Gammill, L. S. Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures. J. Vis. Exp. (184), e63799, doi:10.3791/63799 (2022).