Vi beskriver en tilnærming for å måle endringer i fotosyntetisk effektivitet i anlegg etter behandling med lav CO2 ved bruk av klorofyllfluorescens.
Fotosyntese og fotorespirasjon representerer de største karbonfluksene i plantens primære metabolisme og er nødvendige for planteoverlevelse. Mange av enzymer og gener som er viktige for fotosyntese og fotorespirasjon har blitt godt studert i flere tiår, men noen aspekter av disse biokjemiske veiene og deres crosstalk med flere subcellulære prosesser er ennå ikke fullt ut forstått. Mye av arbeidet som har identifisert gener og proteiner som er viktige i plantemetabolisme, har blitt utført under svært kontrollerte miljøer som kanskje ikke best representerer hvordan fotosyntese og fotorespirasjon fungerer under naturlige og oppdrettsmiljøer. Tatt i betraktning at abiotisk stress resulterer i nedsatt fotosyntetisk effektivitet, er det nødvendig med utvikling av en høy gjennomstrømningsskjerm som kan overvåke både abiotisk stress og dens innvirkning på fotosyntese.
Derfor har vi utviklet en relativt rask metode for å screene for abiotiske stressinduserte endringer i fotosyntetisk effektivitet som kan identifisere ukarakteriserte gener med roller i fotorespirasjon ved hjelp av klorofyllfluorescensanalyse og lav CO2 screening. Dette papiret beskriver en metode for å studere endringer i fotosyntetisk effektivitet i overførte DNA (T-DNA) knockout mutanter i Arabidopsis thaliana. Den samme metoden kan brukes til screening av etylmetansulfonat (EMS)-induserte mutanter eller suppressorscreening. Ved hjelp av denne metoden kan identifisere genkandidater for videre studier i plantens primære metabolisme og abiotiske stressresponser. Data fra denne metoden kan gi innsikt i genfunksjon som kanskje ikke gjenkjennes før eksponering for økte stressmiljøer.
Abiotiske stressforhold som ofte ses i bondens felt, kan påvirke avlingene negativt ved å redusere fotosyntetisk effektivitet. Skadelige miljøforhold som varmebølger, klimaendringer, tørke og saltholdighet i jord kan forårsake abiotiske påkjenninger som endrer CO2-tilgjengeligheten og reduserer plantens respons på høyt lysstress. De to største terrestriske karbonfluksene er fotosyntese og fotorespirasjon, som er avgjørende for plantevekst og avlinger. Mange av de viktige proteinene og enzymene som er involvert i disse prosessene har blitt karakterisert under laboratorieforhold og identifisert på genetisk nivå1. Selv om det er gjort store fremskritt i forståelsen av fotosyntese og fotorespirasjon, forblir mange trinn, inkludert transport mellom planteorganeller, ukarakteriserte 2,3.
Fotorespirasjon, den nest største karbonfluksen i planter etter fotosyntese, begynner når enzymet Rubisco fikserer oksygen i stedet for karbondioksid til ribulose 1,5 bisfosfat (RuBP), og genererer den hemmende forbindelsen 2-fosfoglykolat (2PG)1. For å minimere de hemmende effektene av 2PG og for å resirkulere det tidligere faste karbonet, har C3-planter utviklet den multiorganellære prosessen med fotorespirasjon. Fotorespirasjon konverterer to molekyler av 2PG til ett molekyl av 3-fosfoglyserat (3PGA), som kan komme inn i C3-karbonfikseringssyklusen1. Dermed konverterer fotorespirasjon bare 75% av det tidligere faste karbonet fra genereringen av 2PG og forbruker ATP i prosessen. Som et resultat er prosessen med fotorespirasjon et betydelig 10% -50% drag på fotosyntetisk prosess, avhengig av vanntilgjengelighet og vekstsesongtemperaturer4.
Enzymene som er involvert i fotorespirasjon har vært et forskningsområde i flere tiår, men bare et lite antall transportproteiner har blitt karakterisert på genetisk nivå, selv om minst 25 transporttrinn er involvert i prosessen 5,6,7. De to transportproteinene som er direkte involvert i bevegelsen av karbon generert i fotorespirasjonsprosessen er plastidisk glykolat / glyserattransportør PLGG1 og gallesyrenatriumsymporter BASS6, som begge er involvert i eksport av glykolat fra kloroplast 5,6.
Under ambient [CO2] fikserer Rubisco et oksygenmolekyl til RuBP omtrent 20% av tiden1. Når planter blir utsatt for lav [CO 2], øker fotorespirasjonshastigheten, noe som gjør lav [CO2] til et ideelt miljø for å teste for mutanter som kan være viktige under forhøyet fotorespirasjonsstress. Testing av ytterligere antatt kloroplasttransportprotein T-DNA-linjer under lav CO2 i 24 timer og måling av endringer i klorofyllfluorescens førte til identifisering av bass6-1 plantelinjer som viste en fotorespirasjonsmutant fenotype5. Videre karakterisering viste at BASS6 er en glykolattransportør i kloroplastens indre membran.
Dette papiret beskriver i detalj en protokoll som ligner på det som opprinnelig ble brukt til å identifisere BASS6 som en fotorespirasjonstransportør, som kom fra en liste over antatte transportproteiner lokalisert i kloroplastmembranen8 Denne protokollen kan brukes i et høykapasitetseksperiment som karakteriserer Arabidopsis T-DNA-mutanter eller EMS-genererte mutantplanter som en måte å identifisere gener som er viktige for å opprettholde fotosyntetisk effektivitet under en rekke abiotiske spenninger som varme, høyt lysstress, tørke og CO2-tilgjengelighet . Screening av plantemutanter ved hjelp av klorofyllfluorescens har tidligere blitt brukt til raskt å identifisere gener som er viktige for primær metabolisme9. Med så mye som 30% av Arabidopsis-genomet som inneholder gener som koder for proteiner med ukjent eller dårlig karakterisert funksjon, kan stressindusert analyse av fotosyntetisk effektivitet gi innsikt i molekylære funksjoner som ikke observeres under kontrollerte forhold i mutante planter10. Målet med denne metoden er å identifisere mutanter av fotorespiratorisk vei ved hjelp av en lav CO2 screening . Vi presenterer en metode for å identifisere mutanter som forstyrrer fotorespirasjon etter eksponering for lav CO2. En fordel med denne metoden er at det er en høy gjennomstrømningsscreening for frøplanter som kan gjøres på relativt kort tid. Videoprotokollseksjonene gir detaljer om frøforberedelse og sterilisering, plantevekst og lav CO2-behandling , konfigurasjonen av fluorescensavbildningssystemet, måling av kvanteutbytte av de behandlede prøvene, representative resultater og konklusjoner.
De eksperimentelle metodene som er skissert i denne artikkelen, har noen fordeler og begrensninger. En fordel er at denne metoden kan skjerme mange planteplanter, selv om det må tas noen forholdsregler for å forhindre forurensning av plantemedieplaten under pletterings- og vekstprosessen. Derfor er det viktig å forsegle Arabidopsis-platene med kirurgisk tape. En annen fordel med dette eksperimentet er at det har en kortere 12 timers fotorespiratorisk stressperiode sammenlignet med det tidligere publiserte arbeidet<sup…
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Louisiana Board of Regents (AWD-AM210544).
1.5 mL microcentrifuge tube | VWR | 10810-070 | container for seed sterilization |
agarose | VWR | 9012-36-6 | chemical used to suspend seeds for ease of plating |
Arabidopsis thaliana seeds (abcb26) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_085232 | arabidopsis seeds used as experimental group |
Arabidopsis thaliana seeds (plgg1-1) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | SALK_053469C | parental arabidopsis seeds |
Arabidopsis thaliana seeds (WT) | ABRC, ordered through TAIR www.arabidopsis.org | Col-0 | arabidopsis wild type seeds used as a control group |
bleach | clorox | generic bleach | chemical used to sterilize seeds |
Carbolime absorbent | Medline products | S232-104-001 | CO2 absorbent |
Closed FluorCam | Photon Systems Instruments | FC 800-C | Fluorescence imager |
FluoroCam FC 800-C | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence imager |
FluoroCam7 | Photon Systems Instruments | Closed FluorCam FC 800-C/1010-S | Fluorescence image analysis software |
Gelzan (plant agar) | Phytotech labs | 71010-52-1 | chemical used to solidify MS media as plates |
glass flask 1 L | Fisherbrand | FB5011000 | container for making and autoclaving MS media |
growth chamber | caron | 7317-50-2 | growth chamber used to grow plants |
Murashige & Skoog Basal Medium with Vitamins & 1.0 g/L MES (MS) | Phytotech labs | M5531 | growth media for arabidopsis seedlings |
potassium Hydroxide (KOH) | Phytotech labs | 1310-58-3 | make as 1 M solution for ph adjustment |
spider lights | Mean Well Enterprises | XLG-100-H-AB | lights used in the light assay |
Square Petri Dish with Grid, sterile | Simport Scientific | D21016 | used to hold MS media for arabidopsis seedlings |
surgical tape | 3M | 1530-1 | tape used to seal plates |
tween 20 | biorad | 9005-64-5 | surfactant used to assist seed sterilization |