Tykkelsen af vævssektioner begrænsede den morfologiske undersøgelse af hudindervationen. Den nuværende protokol beskriver en unik vævsrensningsteknik til at visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vævssektioner under konfokal mikroskopi.
Hud innervering er en vigtig del af det perifere nervesystem. Selvom undersøgelsen af de kutane nervefibre har udviklet sig hurtigt, kommer det meste af forståelsen af deres fordelingsmæssige og kemiske egenskaber fra konventionel histokemisk og immunohistokemisk farvning på tynde vævssektioner. Med udviklingen af vævsrensningsteknikken er det blevet muligt at se de kutane nervefibre på tykkere vævssektioner. Denne protokol beskriver flere fluorescerende farvninger på vævssektioner i en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud af rotte bagfod, de to typiske hårede og glatte hudsteder. Her mærker det calcitonin-genrelaterede peptid de sensoriske nervefibre, mens phalloidin og lymfekarendotelhyaluronanreceptor 1 mærker henholdsvis blod- og lymfekarrene. Under et konfokalt mikroskop blev de mærkede sensoriske nervefibre fulgt fuldstændigt på længere afstand og løb i bundter i det dybe kutane lag og freestyle i det overfladiske lag. Disse nervefibre løb parallelt med eller omringede blodkarrene, og lymfekar dannede et tredimensionelt (3D) netværk i den hårede og glatte hud. Den nuværende protokol giver en mere effektiv tilgang til at studere hudindervation end de eksisterende konventionelle metoder fra metodeperspektivet.
Huden, det største organ i kroppen, der tjener som en vigtig grænseflade til miljøet, er tæt innerveret af mange nervefibre 1,2,3. Selvom hudindervation tidligere er blevet bredt undersøgt med forskellige histologiske metoder, såsom farvning på helmonterede hud- og vævsafsnit 4,5,6, er den detaljerede effektive demonstration af kutane nervefibre stadig en udfordring 7,8. I betragtning af dette udviklede den nuværende protokol en unik teknik til at udvise kutane nervefibre tydeligere i tykvævssektionen.
På grund af grænsen for tykkelsen af sektioner er observationen af innerverede hudnervefibre ikke præcis nok til nøjagtigt at skildre forholdet mellem calcitonin-genrelaterede peptid (CGRP) nervefibre og lokale væv og organer fra den erhvervede billedinformation. Fremkomsten af 3D-vævsrensningsteknologi giver en gennemførlig metode til at løse dette problem 9,10. Den hurtige udvikling af vævsrydningsmetoder har tilbudt mange værktøjer til undersøgelse af vævsstrukturer, hele organer, neuronale projektioner og hele dyr i nyere tid11. Det gennemsigtige hudvæv kunne afbildes i en meget tykkere sektion ved konfokal mikroskopi for at få dataene til at visualisere kutane nervefibre.
I den aktuelle undersøgelse blev plantar og dorsal hud af en rotte bagfod valgt som de to målsteder for behåret og glat hud 3,4,7. For at spore de kutane nervefibre på længere afstand blev hudvævet skåret i tykkelsen af 300 μm til immunohistokemisk og histokemisk farvning efterfulgt af vævsrensningsbehandling. CGRP blev brugt til at mærke de sensoriske nervefibre12,13. For at fremhæve de kutane nervefibre på vævsbaggrunden blev phalloidin og lymfekar endotelhyaluronanreceptor 1 (LYVE1) yderligere brugt til at mærke blodkarrene og lymfekarrene henholdsvis14,15.
Disse tilgange gav en ligetil metode, der kan anvendes til at demonstrere et højopløsningsbillede af de kutane nervefibre og også til at visualisere den rumlige sammenhæng mellem nervefibre, blodkar og lymfekar i huden, hvilket kan give meget mere information til at forstå homeostase i den normale hud og kutan ændring under de patologiske tilstande.
Denne undersøgelse giver en detaljeret demonstration af de kutane nervefibre i den hårede og glatte hud ved at bruge immunfluorescens på tykkere vævssektioner med rydningsbehandling og en 3D-visning for at forstå hudens innervering bedre. Antistofinkubationstiden på op til 1-2 dage og en rengøringsproces natten over er vigtige. Disse to nøgletrin påvirker direkte immunfluorescensfarvningseffekten af tykke sektioner. Et yderligere problem blev rejst fra valget af antistoffer, som ikke alle er egnede til tykke sek…
The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev støttet af China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (projektkode nr. ZYYCXTD-D-202202).
1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |