Demonstration af behåret og glat hudindervation i et 3D-mønster ved hjælp af flere fluorescerende farvnings- og vævsrensningsmetoder
Summary
Tykkelsen af vævssektioner begrænsede den morfologiske undersøgelse af hudindervationen. Den nuværende protokol beskriver en unik vævsrensningsteknik til at visualisere kutane nervefibre i tykke 300 μm vævssektioner under konfokal mikroskopi.
Abstract
Hud innervering er en vigtig del af det perifere nervesystem. Selvom undersøgelsen af de kutane nervefibre har udviklet sig hurtigt, kommer det meste af forståelsen af deres fordelingsmæssige og kemiske egenskaber fra konventionel histokemisk og immunohistokemisk farvning på tynde vævssektioner. Med udviklingen af vævsrensningsteknikken er det blevet muligt at se de kutane nervefibre på tykkere vævssektioner. Denne protokol beskriver flere fluorescerende farvninger på vævssektioner i en tykkelse på 300 μm fra plantar og dorsal hud af rotte bagfod, de to typiske hårede og glatte hudsteder. Her mærker det calcitonin-genrelaterede peptid de sensoriske nervefibre, mens phalloidin og lymfekarendotelhyaluronanreceptor 1 mærker henholdsvis blod- og lymfekarrene. Under et konfokalt mikroskop blev de mærkede sensoriske nervefibre fulgt fuldstændigt på længere afstand og løb i bundter i det dybe kutane lag og freestyle i det overfladiske lag. Disse nervefibre løb parallelt med eller omringede blodkarrene, og lymfekar dannede et tredimensionelt (3D) netværk i den hårede og glatte hud. Den nuværende protokol giver en mere effektiv tilgang til at studere hudindervation end de eksisterende konventionelle metoder fra metodeperspektivet.
Introduction
Huden, det største organ i kroppen, der tjener som en vigtig grænseflade til miljøet, er tæt innerveret af mange nervefibre 1,2,3. Selvom hudindervation tidligere er blevet bredt undersøgt med forskellige histologiske metoder, såsom farvning på helmonterede hud- og vævsafsnit 4,5,6, er den detaljerede effektive demonstration af kutane nervefibre stadig en udfordring 7,8. I betragtning af dette udviklede den nuværende protokol en unik teknik til at udvise kutane nervefibre tydeligere i tykvævssektionen.
På grund af grænsen for tykkelsen af sektioner er observationen af innerverede hudnervefibre ikke præcis nok til nøjagtigt at skildre forholdet mellem calcitonin-genrelaterede peptid (CGRP) nervefibre og lokale væv og organer fra den erhvervede billedinformation. Fremkomsten af 3D-vævsrensningsteknologi giver en gennemførlig metode til at løse dette problem 9,10. Den hurtige udvikling af vævsrydningsmetoder har tilbudt mange værktøjer til undersøgelse af vævsstrukturer, hele organer, neuronale projektioner og hele dyr i nyere tid11. Det gennemsigtige hudvæv kunne afbildes i en meget tykkere sektion ved konfokal mikroskopi for at få dataene til at visualisere kutane nervefibre.
I den aktuelle undersøgelse blev plantar og dorsal hud af en rotte bagfod valgt som de to målsteder for behåret og glat hud 3,4,7. For at spore de kutane nervefibre på længere afstand blev hudvævet skåret i tykkelsen af 300 μm til immunohistokemisk og histokemisk farvning efterfulgt af vævsrensningsbehandling. CGRP blev brugt til at mærke de sensoriske nervefibre12,13. For at fremhæve de kutane nervefibre på vævsbaggrunden blev phalloidin og lymfekar endotelhyaluronanreceptor 1 (LYVE1) yderligere brugt til at mærke blodkarrene og lymfekarrene henholdsvis14,15.
Disse tilgange gav en ligetil metode, der kan anvendes til at demonstrere et højopløsningsbillede af de kutane nervefibre og også til at visualisere den rumlige sammenhæng mellem nervefibre, blodkar og lymfekar i huden, hvilket kan give meget mere information til at forstå homeostase i den normale hud og kutan ændring under de patologiske tilstande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne undersøgelse giver en detaljeret demonstration af de kutane nervefibre i den hårede og glatte hud ved at bruge immunfluorescens på tykkere vævssektioner med rydningsbehandling og en 3D-visning for at forstå hudens innervering bedre. Antistofinkubationstiden på op til 1-2 dage og en rengøringsproces natten over er vigtige. Disse to nøgletrin påvirker direkte immunfluorescensfarvningseffekten af tykke sektioner. Et yderligere problem blev rejst fra valget af antistoffer, som ikke alle er egnede til tykke sek…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkode nr. CI2021A03404) og National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary Innovation Fund (projektkode nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
Riferimenti
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
