여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.
Summary
조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.
Abstract
피부 신경은 말초 신경계의 중요한 부분입니다. 피부 신경 섬유에 대한 연구가 빠르게 진행되었지만, 분포 및 화학적 특성에 대한 대부분의 이해는 얇은 조직 절편에 대한 기존의 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색에서 비롯됩니다. 조직 제거 기술의 발달로, 더 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 볼 수있게되었습니다. 본 프로토콜은 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부로부터 300 μm의 두께로 조직 절편에 대한 다중 형광 염색을 기술하며, 두 개의 전형적인 털이 많고 윤곽이 있는 피부 부위이다. 여기서, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 감각신경섬유를 표지하는 반면, 팔로이드인과 림프관내피히알루로난 수용체 1은 혈액과 림프관을 각각 표지한다. 공초점 현미경 하에서, 라벨이 붙은 감각 신경 섬유는 더 먼 거리에서 완전히 추적되었고, 깊은 피부 층의 번들과 피상층의 자유형으로 달렸다. 이 신경 섬유는 혈관과 평행하거나 혈관을 둘러싸고 있었고, 림프관은 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3차원(3D) 네트워크를 형성했다. 현재의 프로토콜은 방법론 관점에서 기존의 기존의 방법보다 피부 신경을 연구하는 데보다 효과적인 접근법을 제공합니다.
Introduction
신체에서 가장 큰 기관인 피부는 환경에 대한 핵심 인터페이스 역할을하며 많은 신경 섬유 1,2,3에 의해 조밀하게 신경을 씁니다. 피부 신경과민은 이전에 전체 탑재 피부 및 조직 절편 4,5,6에 대한 염색과 같은 다양한 조직학적 방법으로 널리 연구되었지만, 피부 신경 섬유의 상세한 효과적인 입증은 여전히 과제입니다 7,8. 이를 감안할 때, 본 프로토콜은 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 보다 명확하게 나타낼 수 있는 독특한 기술을 개발하였다.
절편의 두께에 의한 한계 때문에, 신경과민된 피부 신경 섬유의 관찰은 획득된 이미지 정보로부터 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 신경 섬유와 국소 조직 및 기관 사이의 관계를 정확하게 묘사하기에 충분히 정확하지 않다. 3D 조직 제거 기술의 출현은 이러한 문제(9,10)를 해결할 수 있는 실현 가능한 방법을 제공한다. 조직 제거 접근법의 빠른 개발은 최근11 시간 동안 조직 구조, 전체 장기, 신경 세포 돌기 및 전체 동물을 연구하기위한 많은 도구를 제공했습니다. 투명한 피부 조직은 공초점 현미경으로 훨씬 더 두꺼운 단면에서 이미징되어 피부 신경 섬유를 시각화하는 데이터를 얻을 수 있습니다.
본 연구에서, 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부는 털이 많고 윤곽이 있는 피부 3,4,7의 두 가지 표적 부위로서 선택되었다. 피부 신경 섬유를 더 먼 거리에서 추적하기 위해, 피부 조직을 면역조직화학 및 조직화학적 염색을 위해 300 μm의 두께로 슬라이스하고, 이어서 조직 소거 처리를 하였다. CGRP는 감각 신경 섬유12,13을 라벨링하는데 사용되었다. 또한, 조직 배경에 피부 신경 섬유를 강조하기 위해, 팔로이드인 및 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE1)을 혈관과 림프관을 각각14,15로 표지하기 위해 추가로 사용하였다.
이러한 접근법은 피부 신경 섬유의 고해상도 뷰를 입증하고 또한 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관 간의 공간적 상관 관계를 시각화하기 위해 적용 할 수있는 간단한 방법을 제공했으며, 이는 병리학 적 조건 하에서 정상 피부의 항상성 및 피부 변화를 이해하는 데 훨씬 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본 연구는 클리어링 처리와 함께 두꺼운 조직 절편에 대한 면역 형광을 사용하여 털이 많고 글래브러스 피부에서 피부 신경 섬유의 상세한 시연을 제공하고 피부 신경을 더 잘 이해하기 위한 3D 뷰를 제공합니다. 최대 1-2일의 항체 인큐베이션 시간 및 하룻밤 세척 과정이 중요하다. 이 두 가지 주요 단계는 두꺼운 절편의 면역 형광 염색 효과에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체의 선택으로부터 또 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 의학 과학 혁신 기금의 중국 아카데미에 의해 지원되었다 (프로젝트 코드 번호. CI2021A03404) 및 국가 전통 중국 의학 학제 간 혁신 기금 (프로젝트 코드 번호. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
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