Demonstrera hårig och glättig hudinnervation i ett 3D-mönster med hjälp av flera fluorescerande färgnings- och vävnadsrensningsmetoder
Summary
Tjockleken på vävnadssektioner begränsade den morfologiska studien av hudens innervation. Det nuvarande protokollet beskriver en unik vävnadsrensningsteknik för att visualisera kutana nervfibrer i tjocka 300 μm vävnadssektioner under konfokalmikroskopi.
Abstract
Hudinnervation är en viktig del av det perifera nervsystemet. Även om studien av de kutana nervfibrerna har utvecklats snabbt, kommer det mesta av förståelsen av deras fördelnings- och kemiska egenskaper från konventionell histokemisk och immunohistokemisk färgning på tunna vävnadssektioner. Med utvecklingen av vävnadsrensningstekniken har det blivit möjligt att se de kutana nervfibrerna på tjockare vävnadssektioner. Det nuvarande protokollet beskriver flera fluorescerande färgning på vävnadssektioner med en tjocklek av 300 μm från plantar- och dorsalhuden på råtta bakfot, de två typiska håriga och glättiga hudställena. Här märker den kalcitoningenrelaterade peptiden de sensoriska nervfibrerna, medan falloidin och lymfkärlen endotelial hyaluronanreceptor 1 märker blodet respektive lymfkärlen. Under ett konfokalmikroskop följdes de märkta sensoriska nervfibrerna helt på längre avstånd, som löpte i buntar i det djupa kutana skiktet och freestyle i det ytliga lagret. Dessa nervfibrer löpte parallellt med eller omgav blodkärlen, och lymfkärl bildade ett tredimensionellt (3D) nätverk i den håriga och glättiga huden. Det nuvarande protokollet ger ett mer effektivt tillvägagångssätt för att studera hudens innervation än de befintliga konventionella metoderna ur metodperspektivet.
Introduction
Huden, det största organet i kroppen, som fungerar som ett viktigt gränssnitt till miljön, är tätt innerverat av många nervfibrer 1,2,3. Även om hudinnervation har studerats i stor utsträckning tidigare med olika histologiska metoder, såsom färgning på helmonterad hud ochvävnadssektioner 4,5,6, är den detaljerade effektiva demonstrationen av kutana nervfibrer fortfarande en utmaning 7,8. Med tanke på detta utvecklade det nuvarande protokollet en unik teknik för att uppvisa kutana nervfibrer tydligare i den tjocka vävnadssektionen.
På grund av gränsen för sektionernas tjocklek är observationen av innerverade hudnervfibrer inte tillräckligt exakt för att exakt skildra förhållandet mellan kalcitoningenrelaterad peptid (CGRP) nervfibrer och lokala vävnader och organ från den förvärvade bildinformationen. Framväxten av 3D-vävnadsrensningsteknik ger en genomförbar metod för att lösa detta problem 9,10. Den snabba utvecklingen av vävnadsrensningsmetoder har erbjudit många verktyg för att studera vävnadsstrukturer, hela organ, neuronala projektioner och hela djur på senare tid11. Den transparenta hudvävnaden kan avbildas i en mycket tjockare sektion med konfokalmikroskopi för att erhålla data för att visualisera kutana nervfibrer.
I den aktuella studien valdes plantar- och rygghuden hos en råtta bakfot som de två målplatserna för hårig och glättig hud 3,4,7. För att spåra de kutana nervfibrerna på ett längre avstånd skivades hudvävnaden med tjockleken 300 μm för immunohistokemisk och histokemisk färgning, följt av vävnadsrensningsbehandling. CGRP användes för att märka de sensoriska nervfibrerna 12,13. Dessutom, för att markera de kutana nervfibrerna på vävnadsbakgrunden, användes falloidin och lymfkärlendotelial hyaluronanreceptor 1 (LYVE1) ytterligare för att märka blodkärlen respektive lymfkärlen14,15.
Dessa tillvägagångssätt gav en enkel metod som kan tillämpas för att visa en högupplöst bild av de kutana nervfibrerna och även för att visualisera den rumsliga korrelationen mellan nervfibrerna, blodkärlen och lymfkärlen i huden, vilket kan ge mycket mer information för att förstå homeostasen hos den normala huden och den kutana förändringen under de patologiska förhållandena.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den aktuella studien ger en detaljerad demonstration av de kutana nervfibrerna i den håriga och glättiga huden genom att använda immunofluorescens på tjockare vävnadssektioner med rensande behandling och en 3D-vy för att förstå hudens innervation bättre. Antikroppsinkubationstiden på upp till 1-2 dagar och en rengöringsprocess över natten är viktiga. Dessa två viktiga steg påverkar direkt immunofluorescensfärgningseffekten av tjocka sektioner. Ett ytterligare problem togs upp från valet av antikroppar, s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av China Academy of Chinese Medical Sciences Innovation Fund (projektkod nr. CI2021A03404) och National Traditional Chinese Medicine Interdisciplinary innovation Fund (projektkod nr. ZYYCXTD-D-202202).
Materials
| 1x phosphate-buffered saline | Solarbio Life Sciences | P1020 | pH 7.2-7.4, 0.01 Mol |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Sigma Life Science | T48402-5G | |
| Confocal fluorescence microscopy | Olympus Corporation | Fluoview FV1200 | |
| Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488 | Abcam plc. | ab150105 | |
| Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405 | Abcam plc. | ab175676 | |
| EP tube | Wuxi NEST Biotechnology Co. | 615001 | 1.5 mL |
| Freezing stage sliding microtome system | Leica Biosystems | CM1860 | |
| Imaris Software | Oxford Instruments | v.9.0.1 | |
| IRIS standard scissor | WPI (World Precision Instruments Inc.) | 503242 | |
| iSpacer | SunJin Lab co. | IS005 | |
| Micro forceps-Str | RWD | F11020-11 | |
| Mouse monoclonal anti-CGRP antibody | Santa cruz biotechnology, Inc. | sc-57053 | |
| Neutral buffered Formalin | Solarbio Life Sciences | G2161 | 10% |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 017-000-12 | 10 mL |
| Peristaltic pump | Longer Precision Pump Co., Ltd | BT300-2J | |
| Phalloidin Alexa-Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A12381 | |
| RapiClear 1.52 solution | SunJin Lab co. | RC152001 | 10 mL |
| Regular agarose | Gene Company Limited | G-10 | |
| SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str | RWD | F13038-12 | |
| Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody | R&D Systems, Inc. | AF7939 | |
| Six-well plate | Corning Incorporated | 3335 | |
| Sodium azide | Sigma Life Science | S2002 | 25 g |
| Sucrose | Sigma Life Science | V900116 | 500 g |
| Super Glue | Henkel AG & Co. | Pattex 502 | |
| Surgical Handles | RWD | S32003-12 | |
| Triton X-100 | Solarbio Life Sciences | 9002-93-1 | 100 mL |
| Urethane | Sigma Life Science | U2500 | 500 g |
| VANNAS spring scissors | RWD | S1014-12 | |
| Vibratory microtome | Leica Biosystems | VT1200S |
Riferimenti
- Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design. Cell Proliferation. 52 (6), 12677 (2019).
- Wu, H., Williams, J., Nathans, J. Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling. Elife. 1, 00181 (2012).
- Pomaville, M. B., Wright, K. M. Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation. Currents Protocols. 1 (5), 121 (2021).
- Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study. Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. Journal of Visualized Experiments. (88), e51749 (2014).
- Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution. Journal of Visualized Experiments. (133), e57406 (2018).
- Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity. Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin. Journal of Visualized Experiments. (126), e56106 (2017).
- Yokomizo, T., et al. Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos. Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).
- Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method. Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).
- Pende, M., et al. High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster. Nature Communications. 9 (1), 4731 (2018).
- Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
- Wang, J., et al. Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing. Journal of Visualized Experiments. (167), e61742 (2021).
- Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).
- Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Liang, H., et al. CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations. Journal of Visualized Experiments. (114), e54401 (2016).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Cai, R., et al. Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections. Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).
- Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing. Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).
- Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
- Chazotte, B. Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).
- Breslin, J. W., et al. Lymphatic vessel network structure and physiology. Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).
- Schwager, S., Detmar, M. Inflammation and lymphatic function. Frontiers in Immunology. 10, 308 (2019).
- Hagan, I. M. Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates. Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).
