Denne protokol beskriver dannelsen af en hud-fascia-eksplantation nævnt “SCar-lignende væv i en skål” eller SCAD. Denne model tillader hidtil uset visualisering af enkeltfibroblaster under ardannelse.
Pattedyrs globale reaktion på forsegling af dybe vævssår er gennem ardannelse og vævskontraktion, medieret af specialiserede fasciafibroblaster. På trods af den kliniske betydning af ardannelse og nedsat sårheling er vores forståelse af fascia fibroblastdynamik i sårheling kortvarig på grund af manglen på relevante assays, der muliggør direkte visualisering af fibroblastkoreografi og dynamik i komplekse miljøer som i hudsår. Dette papir præsenterer en protokol til generering af ex situ hudar ved hjælp af SCAD eller “SCar-lignende væv i en skål”, der efterligner det komplekse miljø af hudsår. I dette assay udskæres 2 mm fuld tykkelse hud og dyrkes på hovedet i medier i 5 dage, hvor ar og hudkontrakturer udvikler sig ensartet. Denne metode kombineret med fibroblast-afstamningsspecifikke transgene musemodeller muliggør visualisering af individuelle fibroblastafstrigninger på tværs af hele sårreparationsprocessen. Samlet set hjælper denne protokol forskere med at forstå grundlæggende processer og mekanismer til sårreparation og direkte udforske virkningerne af modulatorer på sårhelingsresultater.
Sårheling er en proces med restaurering af brudte sår. Vævsskader hos hvirvelløse dyr resulterer i delvis eller fuldstændig regenerering. I modsætning hertil reagerer pattedyr på dyb skade ved ardannelse, en proces, der er skræddersyet til hurtigt at forsegle sår med tætte propper af matrixfibre, der minimerer det brudte område og samtidig permanent deformerer det skadede sted 1,2,3. Store hudforbrændinger eller dybe åbne sår hos pattedyr resulterer i patologiske fænotyper såsom hypertrofiske eller keloide ar 4,5. Disse sprudlende ar forårsager en enorm byrde for kliniske og globale sundhedssystemer. Alene i USA koster arhåndtering omkring 10 milliarder dollars årligt 6,7. Derfor er det nødvendigt at udvikle relevante metoder for bedre at forstå de fundementale processer og mekanismer, der er involveret i ardannelse.
I de senere år har en bred vifte af undersøgelser i mus afsløret heterogene fibroblastpopulationer med forskellige funktionelle potenser baseret på deres oprindelse på visse hudsteder 8,9,10. I ryghud identificerede Rinkevich et al., 2015, at en specifik fibroblastpopulation med et tidligt embryonalt udtryk for Engrailed-1 (En1), betegnet EPF (Engrailed positive fibroblast) bidrager til kutan ardannelse ved såring. Omvendt bidrager en anden fibroblast-slægt uden historie med engrailed ekspression, Engrailed negative fibroblast (ENF), ikke til ardannelse8. Skæbnekortlægning af disse En1-slægter ved hjælp af Cre-drevne transgene muselinjer krydset til fluorescensreportermuslinjer såsom R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) muliggør visualisering af EPF- og ENF-populationer.
At studere fibroblastmigration in vivo over flere dage er begrænset af etiske og tekniske begrænsninger. Desuden er sammensatte, virale og neutraliserende antistofbiblioteksskærme til modulering af veje, der er involveret i ardannelse, teknisk udfordrende. Tidligere anvendte in vitro- eller ex vivo-modeller mangler evnen til at visualisere fibroblastmigration og ardannelse i ægte hudmikromiljøer, ensartethed i arudvikling samt vævskompleksitet, der efterligner in vivo-hudmiljøer 11,12. For at overvinde ovenstående begrænsninger udviklede vi et ex vivo ardannelsesassay nævnt SCAD (SCar-lignende væv i en skål)13,14. Dette enkle assay kan udføres ved at udskære 2 mm hud i fuld tykkelse, der indeholder epidermis, dermis og subkutane fasciaregioner og dyrke dem i serumstædsede DMSO-medier i op til 5 dage. Ar genereret fra SCAD replikerer pålideligt transkriptomiske og proteomiske kendetegn ved in vivo-ar. Derudover tillader SCAD’er genereret fra relevante transgene muselinjer (f.eks. En1-mus) krydset med fluorescerende reportermuslinjer visualisering af fibroblastmigrationsdynamik og arudvikling i en hidtil uset opløsning. Desuden kan denne model let tilpasses til alle applikationer med høj gennemstrømning (f.eks. Sammensat bibliotek, antistofbibliotek eller viral screening)13,14. I denne artikel beskriver vi en optimeret protokol til at generere SCAD’er og efterfølgende downstream-behandlingsapplikationer til at studere cellulær og matrixdynamik i arudvikling.
Flere modeller er allerede udviklet til at forstå ardannelse efter skade. Selv om der er gjort mange fremskridt i denne henseende, men de faktiske mekanismer er stadig ikke klare. I modsætning til den tidligere teknik inkorporerer SCAD-modellen alle celletyper og kutane lag og opretholder derved kompleksiteten af indfødt hud18,19. Denne metode er i stand til at generere grundlæggende datasæt, der er vigtige for at forstå molekylære mekanismer, der driver a…
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkender alle medforfatterne af Jiang et al. 2020 for at bidrage til udviklingen af SCAD-metoden13. Vi takker Dr. Steffen Dietzel og Bioimaging-kerneanlægget ved Ludwig-Maximilans-Universität for adgang til Multiphoton-systemet. Y.R. blev støttet af Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), European Research Council Consolidator Grant (ERC-CoG 819933) og LEO Fondet (LF-OC-21-000835).
10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |