뇌에서 아밀로이드 피브릴 코어의 생화학 적 정제 및 프로테오믹 특성화
Summary
질량 분광법 기반 프로테오믹 분석을 통한 이 생화학적 정제 방법은 아밀로이드 피브릴 코어의 강력한 특성화를 용이하게 하며, 이는 알츠하이머병 예방을 위한 표적의 식별을 가속화할 수 있다.
Abstract
단백질성 섬유소 내포물은 다수의 신경 퇴행성 질환의 주요 병리학적 특징이다. 알츠하이머 병 (AD)의 초기 단계에서 아밀로이드 베타 펩티드는 세포외 공간에서 프로토 피브릴을 형성하며, 이는 점차 성장하고 큰 아밀로이드 플라크로 성숙하는 씨앗 역할을합니다. 이러한 기본적인 이해에도 불구하고, 뇌의 아밀로이드 피브릴 구조, 조성 및 증착 패턴에 대한 현재의 지식은 제한적입니다. 한 가지 주요 장벽은 뇌 추출물에서 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리 할 수 없다는 것입니다. 친화성 정제 및 레이저 포획 미세해부-기반 접근법은 이전에 아밀로이드를 분리하기 위해 사용되어 왔지만 회수될 수 있는 소량의 물질에 의해 제한된다. 이 새롭고 강력한 프로토콜은 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 및 초음파처리를 통한 소듐 도데실 설페이트 (SDS) 가용화를 사용하여 아밀로이드 플라크 코어의 생화학 적 정제를 설명하고 AD 환자 및 AD 모델 뇌 조직으로부터 고순도 피브릴을 산출합니다. 질량 분광법 (MS)-기반 정제된 물질의 상향식 프로테오믹 분석은 아밀로이드 피브릴의 거의 모든 일차 단백질 성분을 확인하기 위한 강력한 전략을 나타낸다. 아밀로이드 코로나에서 단백질에 대한 이전의 프로테오믹 연구는 예기치 않게 크고 기능적으로 다양한 단백질 모음을 밝혀 냈습니다. 주목할 만하게, 정제 전략을 정제한 후, 공동정제 단백질의 수가 10배 이상 감소하였고, 이는 단리된 SDS 불용성 물질의 고순도를 나타낸다. 음성 염색 및 면역-금 전자 현미경 검사는 이들 제제의 순도의 확인을 허용하였다. 이들 단백질을 아밀로이드 내포물로의 침착에 기여하는 공간적, 생물학적 특성을 이해하기 위해서는 더 많은 연구가 필요하다. 종합하면,이 분석 전략은 아밀로이드 생물학에 대한 이해를 높이기 위해 좋은 위치에 있습니다.
Introduction
아밀로이드는 단백질의 다양한 패널에서 발견되는 매우 안정적인 초분자 배열이며, 그 중 일부는 병리학 적 변화를 일으 킵니다1. 세포내 또는 세포외 아밀로이드 응집체의 축적은 몇몇 신경퇴행성 질환2에서 관찰된다. 아밀로이드 응집체는 이질적이며 많은 수의 단백질 및 지질로 풍부합니다3. 최근 몇 년 동안, 아밀로이드 프로테옴에 대한 관심은 기초 및 번역 신경 과학자들 사이에서 상당한 관심을 불러 일으켰습니다. 마우스 및 사후 인간 뇌 조직에서 아밀로이드 응집체를 추출하고 정제하기 위해 몇 가지 방법이 개발되었습니다. 레이저-포획 미세해부, 면역침전, 탈세포화 및 아밀로이드 응집체의 생화학적 분리는 아밀로이드 플라크, 피브릴 및 올리고머 4,5,6,7을 추출하고 정제하기 위해 널리 사용되는 방법이다. 이러한 연구의 대부분은 반 정량적 MS를 사용하여 이러한 단단히 포장 된 피브릴라 침전물의 단백질 조성을 결정하는 데 중점을 두었습니다. 그러나, 이용가능한 결과는 일관성이 없으며, 이전에 보고된 놀랍게도 많은 수의 공동-정제 단백질들은 해석하기 어렵다.
AD 및 AD 마우스 모델 뇌에서 아밀로이드 코어 프로테옴을 기술하는 기존 문헌의 주요 한계는 정제된 물질이 관리불가능한 수의 공동정제 단백질을 함유한다는 것이다. 이 방법의 전반적인 목표는 이러한 한계를 극복하고 아밀로이드 피브릴 코어를 분리하기위한 강력한 생화학 적 정제를 개발하는 것입니다. 이 전략은 사후 AD 인간 및 마우스 뇌 조직으로부터 SDS 불용성 농축 아밀로이드 분획을 단리하기 위해 이전에 기술된 수크로오스 밀도 구배 초원심분리 기반 생화학적 방법을 이용한다(8,9). 이 방법은 기존 문헌을 기반으로하지만 초음파 처리 및 SDS 세척을 통해 느슨하게 결합 된 아밀로이드 관련 단백질의 대부분을 제거하여 고도로 정제 된 아밀로이드 피브릴을 분리합니다 (그림 1). 이 프로토콜에 의해 정제 된 피브릴은 뇌 추출물에서 분리 된 아밀로이드 피브릴의 구조 연구에서 자주 발생하는 몇 가지 기존 문제를 극복합니다. 투과 전자 현미경 (TEM)으로 이러한 피브릴의 시각화는 정제 된 물질의 무결성과 순도를 확인합니다 (그림 2). 이 연구에서, 분리된 피브릴은 트립신을 갖는 펩티드로 가용화되고 소화되고, 표지가 없는 MS 분석은 피브릴 코어를 형성하는 단백질의 동일성을 용이하게 밝힐 수 있다. 특히, 이들 단백질 중 일부는 비막 결합 소기관에서 초분자 어셈블리를 형성하는 고유 한 경향을 가지고 있습니다. 또한, 아밀로이드 베타 (Aβ) 피브릴의 분석에서 확인 된 많은 단백질은 다른 신경 퇴행성 질환과도 관련이 있으며, 이는 이러한 단백질이 다중 단백질 병증에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다.
이 SDS / 초음파 처리 방법은 피브릴 코어의 구조를 변경하거나 방해하지 않을 것입니다. 정제된 물질은 또한 광범위한 하향식 및 상향식 프로테오믹 분석 접근법 및 추가적인 MS 기반 구조 분석 전략, 예컨대 화학적 가교결합 또는 수소-중수소 교환에 적합하다. 이 방법을 사용하는 전체 회수율은 상대적으로 높기 때문에 정제 된 물질의 마이크로 그램 ~ 밀리그램이 필요한 상세한 구조 연구에 적합합니다. 정제된 물질은 또한 cryoEM 및 원자력 현미경을 이용한 구조 연구에 적합하다. 이 프로토콜은, 포유동물의 안정한 동위원소 표지와 조합하여, 아밀로이드 구조(10)의 고체 핵 자기 공명(NMR) 연구를 촉진할 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
아밀로이드 구조 및 구성에 대한 명확한 이해를 개발하는 것은 AD 뇌 조직16,17에서 정제 된 피브릴을 추출하는 생물학적 복잡성과 실험적 한계로 인해 구조 생물 학자 및 생화학자에게 도전적입니다. 아밀로이드 피브릴은 분자 수준에서 다형성이며, 다양한 길이와 복잡성의 이종 집단을 보여줍니다18,19. 그들?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01AG061865에서 R.J.V. 및 J.N.S.에 의해 지원되었습니다. 저자들은 노스 웨스턴 대학의 Vassar와 Savas 연구 그룹 구성원들에게 사려 깊은 토론에 감사드립니다. 우리는 또한 진심으로 박사 (들)에게 감사드립니다. Ansgar Seimer와 Ralf Langen은 사우스 캘리포니아 대학의 중요한 의견을 제시했습니다. 노스웨스턴 대학교 고급 현미경 센터에서 시료 준비 및 음성 염색 전자 현미경 이미징을 해주신 Farida Korabova 박사님께 감사드립니다.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Riferimenti
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