Purificação Bioquímica e Caracterização Proteômica de Núcleos de Fibril Amiloides do Cérebro
Summary
Este método de purificação bioquímica com análise proteômica baseada em espectrometria de massa facilita a caracterização robusta de núcleos fibril amiloides, o que pode acelerar a identificação de alvos para prevenir a doença de Alzheimer.
Abstract
As inclusões fibrilares proteináceas são marcas patológicas fundamentais de múltiplas doenças neurodegenerativas. Nos estágios iniciais da doença de Alzheimer (DA), peptídeos amilóide-beta formam protofibrilas no espaço extracelular, que agem como sementes que gradualmente crescem e amadurecem em grandes placas amiloides. Apesar dessa compreensão básica, o conhecimento atual da estrutura de fibrila amiloide, composição e padrões de deposição no cérebro é limitado. Uma grande barreira tem sido a incapacidade de isolar fibrilas amiloides altamente purificadas de extratos cerebrais. A purificação de afinidade e as abordagens baseadas em microdissecção de captura a laser foram usadas anteriormente para isolar amiloides, mas são limitadas pela pequena quantidade de material que pode ser recuperada. Este novo protocolo robusto descreve a purificação bioquímica de núcleos de placas amiloides usando solubilização de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) com ultracentrifugação de gradiente de densidade de sacarose e ultrassônicas e produz fibrilas altamente puras de pacientes com DA e tecidos cerebrais modelo AD. A análise proteômica de baixo para cima baseada em espectrometria de massa (MS) do material purificado representa uma estratégia robusta para identificar quase todos os componentes proteicos primários das fibrilas amiloides. Estudos proteômicos anteriores de proteínas na coronária amiloide revelaram uma coleção inesperadamente grande e funcionalmente diversificada de proteínas. Notavelmente, após o refino da estratégia de purificação, o número de proteínas de co-purificação foi reduzido em mais de 10 vezes, indicando a alta pureza do material isolado SDS insolúvel. A coloração negativa e a microscopia eletrônica imuno-ouro permitiram a confirmação da pureza dessas preparações. Outros estudos são necessários para compreender os atributos espaciais e biológicos que contribuem para a deposição dessas proteínas em inclusões amiloides. Em conjunto, essa estratégia analítica está bem posicionada para aumentar a compreensão da biologia amiloide.
Introduction
Amiloide é um arranjo supramolecular extremamente estável que é encontrado em um painel diversificado de proteínas, algumas das quais levam a mudanças patológicas1. O acúmulo de agregados amiloides intra ou extracelulares é observado em várias doenças neurodegenerativas2. Os agregados amiloides são heterogêneos e são enriquecidos com um grande número de proteínas e lipídios3. Nos últimos anos, o interesse pelo proteome amiloide tem gerado interesse substancial entre neurocientistas básicos e translacionais. Vários métodos foram desenvolvidos para extrair e purificar agregados amiloides de tecidos cerebrais humanos de camundongos e pós-morte. Microdisseção de captura a laser, imunoprecipitação, descelularização e isolamento bioquímico de agregados amiloides são métodos amplamente utilizados para extrair e purificar placas amiloides, fibrilas e oligômeros 4,5,6,7. Muitos desses estudos têm se concentrado em determinar a composição proteica desses depósitos fibrilares bem embalados usando em ms semi-quantitativo. No entanto, os resultados disponíveis são inconsistentes, e o número surpreendentemente grande de proteínas co-purificadoras relatadas anteriormente são desafiadores de interpretar.
A principal limitação da literatura existente descrevendo o núcleo amiloide nos cérebros modelo de camundongos AD e AD é que o material purificado contém um número incontrolável de proteínas co-purificadoras. O objetivo global deste método é superar essa limitação e desenvolver uma purificação bioquímica robusta para isolar núcleos de fibrila amiloide. Esta estratégia emprega um método bioquímico baseado em afluente de densidade de sacarose anteriormente descrito para o isolamento de frações amiloides enriquecidas insolúveis da SDS a partir de tecidos cerebrais humanos e camundongos pós-morte 8,9. Este método baseia-se na literatura existente, mas vai além com a ultrassonização e as lavagens SDS para remover a maioria das proteínas amiloides frouxamente ligadas, levando ao isolamento de fibrilas amiloides altamente purificadas (Figura 1). As fibrilas purificadas por este protocolo superam vários desafios existentes frequentemente encontrados em estudos estruturais de fibrilas amiloides isolados de extratos cerebrais. A visualização dessas fibrilas com microscopia eletrônica de transmissão (TEM) confirma a integridade e pureza do material purificado (Figura 2). Neste estudo, as fibrilas isoladas são solubilizadas e digeridas em peptídeos com trippsina, e a análise de MS sem rótulos pode facilmente revelar a identidade das proteínas que formam o núcleo fibril. Notavelmente, algumas dessas proteínas têm uma tendência inerente à formação de conjuntos supramoleculares em organelas não ligadas à membrana. Além disso, muitas das proteínas identificadas na análise de fibrilas amilóide-beta (Aβ) também estão associadas a outras doenças neurodegenerativas, sugerindo que essas proteínas podem desempenhar um papel fundamental em múltiplas proteinopatias.
Este método SDS/ultrasonicação é improvável de alterar ou interromper a estrutura dos núcleos fibril. O material purificado também é adequado para uma ampla gama de abordagens de análise proteômica de cima para baixo e de baixo para cima e estratégias adicionais de análise estrutural baseada em MS, como crosslinking químico ou troca de deutério de hidrogênio. A recuperação geral usando este método é relativamente alta e, portanto, é adequada para estudos estruturais detalhados, que requerem microgramas a miligramas do material purificado. O material purificado também é adequado para estudos estruturais utilizando crioEM e microscopia de força atômica. Este protocolo, em combinação com a rotulagem isotópica estável de mamíferos, pode facilitar estudos de ressonância magnética nuclear de estado sólido (RMN) da estrutura amiloide10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desenvolver uma compreensão clara da estrutura e composição amiloide é um desafio para biólogos e bioquímicos estruturais devido às complexidades biológicas e limitações experimentais na extração de fibrilas purificadas dos tecidos cerebrais da AD16,17. Fibrilas amiloides são polimórficas a nível molecular, mostrando uma população heterogênea de comprimentos e complexidades variados18,19…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela concessão do NIH R01AG061865 a R.J.V. e J.N.S. Os autores agradecem a Vassar e aos membros do grupo de pesquisa Savas na Universidade Northwestern por suas discussões pensativas. Também agradecemos sinceramente ao Dr.s. Ansgar Seimer e Ralf Langen na Universidade do Sul da Califórnia por sua contribuição crucial. Agradecemos ao Dr. Farida Korabova pela preparação da amostra e imagens de microscopia eletrônica de coloração negativa no Centro de Microscopia Avançada da Universidade northwestern.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Riferimenti
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