تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA): اختبار تشخيصي في التليف الكيسي
Summary
يصف هذا البروتوكول تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA) ، وهو اختبار تشخيصي جديد للتليف الكيسي (CF). الخصائص المورفولوجية ، وهي الاستدارة (مؤشر الدائرية ، CI) ووجود التجويف (نسبة الشدة ، الأشعة تحت الحمراء) ، هي مقياس لوظيفة CFTR. أظهر تحليل 189 شخصا تمييزا تاما بين التليف الكيسي وغير التليف الكيسي.
Abstract
تشخيص التليف الكيسي (CF) ليس دائما مباشرا ، خاصة عندما يكون تركيز كلوريد العرق متوسطا و / أو يمكن تحديد أقل من طفرتين من CFTR المسببة للمرض. تم تضمين فحوصات CFTR الفسيولوجية (فرق جهد الأنف ، قياس التيار المعوي) في خوارزمية التشخيص ولكنها ليست دائما متاحة بسهولة أو مجدية (على سبيل المثال ، عند الرضع). عضويات المستقيم هي هياكل 3D التي تنمو من الخلايا الجذعية المعزولة من خبايا خزعة المستقيم عند زراعتها في ظل ظروف محددة. المواد العضوية من الموضوعات غير CF لها شكل دائري وتجويف مملوء بالسوائل ، حيث أن نقل الكلوريد بوساطة CFTR يدفع الماء إلى التجويف. لا تنتفخ المواد العضوية ذات وظيفة CFTR المعيبة ، وتحتفظ بشكل غير منتظم وليس لها تجويف مرئي. يتم تحديد الاختلافات في التشكل بين المواد العضوية CF وغير CF في “تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي” (ROMA) كاختبار فسيولوجي CFTR جديد. بالنسبة لفحص ROMA ، يتم طلاء المواد العضوية في 96 لوحة بئر ، ملطخة بالكالسين ، ويتم تصويرها في مجهر متحد البؤر. يتم قياس الاختلافات المورفولوجية باستخدام مؤشرين: يحدد مؤشر الدائرية (CI) استدارة الكائنات العضوية ، ونسبة الشدة (IR) هي مقياس لوجود تجويف مركزي. تحتوي المواد العضوية غير CF على CI مرتفع ومنخفض IR مقارنة بعضويات CF. ميزت مؤشرات ROMA تماما بين 167 شخصا مصابا بالتليف الكيسي من 22 شخصا بدون التليف الكيسي ، مما يجعل ROMA مقايسة CFTR الفسيولوجية الجذابة للمساعدة في تشخيص التليف الكيسي. يمكن إجراء خزعات المستقيم بشكل روتيني في جميع الأعمار في معظم المستشفيات ويمكن إرسال الأنسجة إلى مختبر مركزي لزراعة الأعضاء وروما. في المستقبل ، يمكن أيضا تطبيق ROMA لاختبار فعالية معدلات CFTR في المختبر. والهدف من هذا التقرير هو تقديم شرح كامل للأساليب المستخدمة في الروما، للسماح بتكرارها في مختبرات أخرى.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو مرض صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء CF (CFTR). بروتين CFTR عبارة عن قناة كلوريد وبيكربونات ، مما يضمن ترطيب العديد من الظهارة1. التليف الكيسي هو مرض عالي العبء ، يقصر العمر ، متعدد الأنظمة ، ويظهر في المقام الأول كمرض تنفسي ، ولكنه يؤثر أيضا على الجهاز الهضمي والبنكرياس والكبد والجهاز التناسلي2.
تؤدي طفرات CFTR المسببة للأمراض إلى انخفاض في كمية أو وظيفة CFTR ، مما يؤدي بدوره إلى جفاف المخاط. تم وصف أكثر من 2000 متغير في جين CFTR 3 ، منها 466 فقط تم توصيفها بدقة4.
يمكن إجراء تشخيص التليف الكيسي عندما يكون تركيز كلوريد العرق (SCC) أعلى من عتبة 60 مليمول / لتر أو عندما يتم تحديد طفرتين من CFTR المسببة للأمراض (وفقا لقاعدة بيانات CFTR2) 4,5. في الأشخاص الذين لديهم SCC مرتفع بشكل متوسط فقط (30-60 مليمول / لتر) ، والذي يحدث في حوالي 4٪ -5٪ من اختبارات العرق6 ، وطفرات CFTR ذات العواقب السريرية المتفاوتة أو غير المعروفة ، لا يمكن تأكيد التشخيص أو استبعاده ، حتى عندما يكون لديهم أعراض متوافقة مع التليف الكيسي أو اختبار فحص حديثي الولادة إيجابي. بالنسبة لهذه الحالات ، تم تضمين فحوصات CFTR الفسيولوجية للخط الثاني (فرق الجهد الأنفي (NPD) وقياسات التيار المعوي (ICM)) في خوارزمية التشخيص. هذه الاختبارات ليست متاحة بسهولة في معظم المراكز ولا يمكن إجراؤها في جميع الأعمار ، خاصة عند الرضع5.
العضويات الشرجية هي هياكل ثلاثية الأبعاد نمت من Lgr5 (+) الخلايا الجذعية المعوية البالغة من الخبايا المعوية التي تم الحصول عليها من خلال خزعة المستقيم7. يتم استخدام المواد العضوية بشكل متزايد في الأبحاث الطبية الحيوية ، مثل اختبار علاج المغير في CF8. يمكن الحصول على خزعة قابلة للحياة إما عن طريق الشفط أو خزعة الملقط ، وهو إجراء لا يسبب سوى الحد الأدنى من الانزعاج وهو آمن حتى عند الرضع ، مع معدلات مضاعفات منخفضة9. يتم إثراء الخبايا المعزولة من خزعات المستقيم في الخلايا الجذعية ، وفي ظل ظروف زراعة محددة ، يتم تنظيمها ذاتيا في عضويات مستقيمية. يتم تحديد مورفولوجيا هذه المواد العضوية من خلال التعبير عن وظيفة CFTR ، الموجودة في الغشاء القمي للخلايا الظهارية. يسمح CFTR الوظيفي للكلوريد والماء بدخول التجويف العضوي ، مما يؤدي إلى تورم المواد العضوية غير CF. لا تنتفخ عضويات CF وليس لها تجويف مرئي10,11.
يسمح تحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA) بالتمييز بين الكائنات العضوية CF وغير CF بناء على هذه الاختلافات في التشكل العضوي. المواد العضوية غير CF أكثر استدارة ولها تجويف مرئي ، في حين أن العكس صحيح بالنسبة للعضويات CF. لهذا الفحص ، يتم طلاء المواد العضوية الخاصة بالمريض في 32 بئرا من صفيحة 96 بئرا. بعد 1 يوم من النمو ، يتم تلطيخ المواد العضوية باللون الأخضر الكالسيين وتصويرها في مجهر متحد البؤر. تظهر المواد العضوية غير CF شكلا دائريا أكثر وجزءا مركزيا أقل فلورية ، حيث يحتوي التجويف على بقع سائلة وكالسيين خلايا فقط. يتم قياس هذه الاختلافات في التشكل باستخدام مؤشرين ROMA: مؤشر الدائرية (CI) يحدد استدارة المواد العضوية ، في حين أن نسبة الشدة (IR) هي مقياس لوجود أو عدم وجود تجويف مركزي. في هذا التقرير ، نصف بالتفصيل بروتوكول الحصول على هذه الفهارس التمييزية ، للسماح بتكرار التقنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن نقدم بروتوكولا مفصلا لتحليل مورفولوجيا المستقيم العضوي (ROMA). قام المؤشران المحسوبان باستخدام ROMA و IR و CI ، بتمييز الكائنات العضوية عن الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي عن أولئك الذين لا يعانون من التليف الكيسي بدقة تامة. وبالتالي يمكن أن تعمل ROMA كاختبار CFTR فسيولوجي جديد مكمل ل SCC والاختبا…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر المرضى وأولياء الأمور الذين شاركوا في هذه الدراسة. نشكر عبيدة بيبي على كل أعمال الزراعة مع الكائنات العضوية. نشكر إلس إيرتجيرتس ، وكارولين برونيل ، وكلير كولارد ، وليليان كوليجنون ، ومونيك ديلفوس ، وأنجا ديلبورت ، وناتالي فيارتس ، وسيسيل لامبريمونت ، ولوت نيوبورج ، وناتالي بيترز ، وآن رامان ، وبيم سانسن ، وهيلدا ستيفنز ، وماريان شولت ، وإلس فان رانسبيك ، وكريستل فان دي براندي ، وجريت فان دن إيندي ، ومارلين فاندركيركين ، وإنجي فان ديك ، وأودري فاجنر ، ومونيكا واسكيفيتش ، وبرنارد ويندريكس على الدعم اللوجستي. كما نشكر Mucovereniging / Association Muco ، وتحديدا ستيفان جوريس والدكتور جان فانليوي ، على دعمهم وتمويلهم. نشكر جميع المتعاونين من مشروع Organoid البلجيكي: هيدويج بوبولي (CHR Citadelle ، لييج ، بلجيكا) ، ليندا بولانجر (مستشفيات جامعة لوفين ، بلجيكا) ، جورج كازيمير (HUDERF ، بروكسل ، بلجيكا) ، بنديكت دي ماير (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، Elke De Wachter (مستشفى جامعة بروكسل ، بلجيكا) ، داني دي لوز (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، إيزابيل إتيان (CHU Erasme ، بروكسل ، بلجيكا) ، لورانس هانسينس (HUDERF ، بروكسل) ، كريستيان نوب (CHU Erasme ، بروكسل ، بلجيكا) ، مونيك ليكين (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا) ، فيكي نوي (مستشفى GZA St. Vincentius في أنتويرب) ، ديرك ستايسن (مستشفى GZA St. Vincentius في أنتويرب) ، ستيفاني فان بيرفليت (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، إيفا فان برايكل (مستشفى جامعة غنت ، بلجيكا) ، كيم فان هورنبيك (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا) ، إيف فاندرهيلست (مستشفى جامعة بروكسل ، بلجيكا) ، Stijn Verhulst (مستشفى جامعة أنتويرب ، بلجيكا)، ستيفاني فينكن (مستشفى جامعة بروكسل، بلجيكا).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
