直肠类器官形态学分析（ROMA）：囊性纤维化的诊断测定

Summary

该协议描述了直肠类器官形态学分析（ROMA），这是一种囊性纤维化（CF）的新型诊断测定。形态特征，即圆度（圆度指数，CI）和流明的存在（强度比，IR），是CFTR功能的量度。对189名受试者的分析表明，CF和非CF之间的区别非常明显。

Abstract

囊性纤维化 （CF） 的诊断并不总是那么简单，尤其是当汗液氯化物浓度中等和/或可以识别出少于两个致病的 CFTR 突变时。生理CFTR测定（鼻电位差，肠电流测量）已包含在诊断流程中，但并不总是容易获得或可行（例如，在婴儿中）。直肠类器官是从直肠活检隐窝分离的干细胞生长的3D结构，在特定条件下培养。来自非CF受试者的类器官具有圆形和充满液体的腔，因为CFTR介导的氯化物运输将水驱动到腔中。具有CFTR功能缺陷的类器官不会肿胀，保持不规则形状并且没有可见的管腔。CF和非CF类器官之间的形态差异在“直肠类器官形态学分析”（ROMA）中量化，作为一种新型CFTR生理测定。对于ROMA测定，将类器官接种在96孔板中，用钙黄绿素染色，并在共聚焦显微镜中成像。形态差异使用两个指标进行量化：圆度指数（CI）量化类器官的圆度，强度比（IR）是中央管腔存在的量度。与CF类器官相比，非CF类器官具有高CI和低IR。ROMA指数完美地区分了167名患有CF的受试者和22名没有CF的受试者，使ROMA成为一种有吸引力的生理CFTR测定，以帮助CF诊断。大多数医院的所有年龄段都可以常规进行直肠活检，组织可以送到中心实验室进行类器官培养和ROMA治疗。将来，ROMA也可能用于体 外测试CFTR调节剂的功效。本报告的目的是充分解释用于ROMA的方法，以便在其他实验室中复制。

Introduction

囊性纤维化（CF）是一种常染色体隐性遗传疾病，由CF跨膜电导调节因子（CFTR）基因突变引起。CFTR蛋白是氯化物和碳酸氢盐通道，确保几个上皮的水合作^用1。CF是一种高负担、缩短寿命的多系统疾病，主要表现为呼吸系统疾病，但也影响胃肠道、胰腺、肝脏和生殖道²。

致病的 CFTR 突变导致CFTR的数量或功能下降，进而导致粘液脱水。已经描述了 CFTR 基因中的2，000多个变异³，其中只有466个被^{彻底表征4}。

当汗液氯化物浓度 （SCC） 高于 60 mmol/L 的阈值或确定出两个致病 CFTR 突变（根据 CFTR2 数据库）时，可以诊断出 CF 4^，5。在仅中度升高（30-60 mmol/L）鳞状细胞癌（发生在约4%-5%的汗液试验中）的受试者中6，以及不同或未知临床后果的CFTR突变，即使他们有CF兼容症状或新生儿^{筛查试验阳性}，也无法确诊或排除诊断。对于这些病例，二线生理CFTR测定（鼻电位差（NPD）和肠电流测量（ICM））已被纳入诊断流程。这些测试在大多数中心并不容易获得，也不是在所有年龄段都可行，尤其是在^{婴儿中 5}.

直肠类器官是从通过直肠活检获得的肠隐窝中的Lgr5（+）成人肠道干细胞生长的3D^结构7。类器官越来越多地用于生物医学研究，例如在CF⁸中测试调节剂治疗。可行的活检可以通过抽吸或镊子活检获得，这种手术仅引起最小的不适，即使在婴儿中也是安全的，^{并发症发生率低}9。从直肠活检中分离的隐窝富含干细胞，并且在特定的培养条件下，这些干细胞自组织成直肠类器官。这些类器官的形态由位于上皮细胞顶膜的CFTR的表达和功能决定。功能性CFTR允许氯化物和水进入类器官腔，从而诱导非CF类器官的肿胀。CF类器官不会膨胀，也没有可见的管腔^10，11。

直肠类器官形态分析（ROMA）允许根据类器官形态的这些差异来区分CF和非CF类器官。非CF类器官更圆，具有可见的管腔，而CF类器官则相反。对于该测定，将患者特异性类器官接种在96孔板的32孔中。生长1天后，将类器官用钙黄绿染色并在共聚焦显微镜中成像。非CF类器官显示出更圆形的形状和较少的荧光中央部分，因为管腔含有液体，而钙黄绿素仅对细胞进行染色。这些形态差异使用两个ROMA指数进行量化：圆形指数（CI）量化类器官的圆度，而强度比（IR）是中央管腔存在与否的量度。在本报告中，我们详细描述了获得这些判别性指标的协议，以允许复制该技术。

Protocol

对于所有涉及人体组织的程序，都获得了伦理委员会研究UZ / KU Leuven（EC研究）的批准。所有研究均在父母、代表和/或患者的知情同意和/或同意下进行。 注意：所有涉及直肠活检和类器官的程序都应在层流中进行，以保护研究人员免受任何生物危害，并将培养物污染的风险降至最低。对于任何实验室程序，研究人员应始终穿着实验室外套，手套和安全护目镜来操作样品。 …

Representative Results

在常规临床访问期间收集了212名受试者的类器官。在直肠活检过程中或之后未发生不良事件。类器官由一名对基因型和临床信息等受试者特征不知情的研究人员进行成像。由于图像质量低下，23名受试者被排除在外。类器官培养和图像采集成功和失败的示例如图 2所示。 分析了 167 名患有 CF 和两种致病 CFTR 突变（由 CFTR2 数据库4 ?…

Discussion

我们为直肠类器官形态分析（ROMA）提供了详细的方案。用ROMA，IR和CI计算的两个指标将类器官与有CF的受试者与没有CF的受试者区分开来，非常准确。因此^，ROMA可以作为一种新型生理CFTR测定，补充SCC和其他目前可用的测试¹³，^14，15。

该方案依赖于肠道类器官的使用，当CFTR起作用时，肠道类器官具有圆形和…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tubes	Sorenson	17040
15 mL conical tubes	VWR	525-0605
24 well plates	Corning	3526
96 well plates	Greiner	655101
Brightfield microscope	Zeiss	Axiovert 40C
Centrifuge	Eppendorf	5702
CO2 incubator	Binder	CB160
Computer	Hewlett-Packard	Z240
Confocal microscope	Zeiss	LSM 800
Laminar flow hood	Thermo Fisher	51025413
Material for organoid culture as detailed in previous protocol10
Micropipettes (20, 200, and 1000 µL)	Eppendorf	3123000039, 3123000055, 3123000063
Microsoft Excel	Microsoft	Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit	Spreadsheet software
NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software	Nikon	v.5.02.00	Imaging software
Pipette tips (20, 200, and 1000 µL)	Greiner	774288, 775353, 750288
Zeiss Zen Blue software	Zeiss	v2.6	Imaging software