Rektal organoid morfologianalyse (ROMA): Et diagnostisk assay i cystisk fibrose
Summary
Denne protokol beskriver rektal organoid morfologianalyse (ROMA), et nyt diagnostisk assay for cystisk fibrose (CF). Morfologiske egenskaber, nemlig rundheden (cirkularitetsindeks, CI) og tilstedeværelsen af et lumen (intensitetsforhold, IR), er et mål for CFTR-funktionen. Analyse af 189 emner viste perfekt diskrimination mellem CF og ikke-CF.
Abstract
Diagnose af cystisk fibrose (CF) er ikke altid ligetil, især når svedchloridkoncentrationen er mellemliggende og / eller mindre end to sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer kan identificeres. Fysiologiske CFTR-assays (nasal potentialforskel, måling af tarmstrøm) er inkluderet i den diagnostiske algoritme, men er ikke altid let tilgængelige eller gennemførlige (f.eks. Hos spædbørn). Rektale organoider er 3D-strukturer, der vokser fra stamceller isoleret fra krypter af en rektal biopsi, når de dyrkes under specifikke forhold. Organoider fra ikke-CF-forsøgspersoner har en rund form og et væskefyldt lumen, da CFTR-medieret kloridtransport driver vand ind i lumen. Organoider med defekt CFTR-funktion svulmer ikke op, bevarer en uregelmæssig form og har ingen synlig lumen. Forskelle i morfologi mellem CF og ikke-CF organoider kvantificeres i ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) som et nyt CFTR fysiologisk assay. Til ROMA-analysen er organoider belagt i 96-brøndsplader, farvet med calcein og afbildet i et konfokalmikroskop. Morfologiske forskelle kvantificeres ved hjælp af to indekser: Cirkularitetsindekset (CI) kvantificerer organoidernes rundhed, og intensitetsforholdet (IR) er et mål for tilstedeværelsen af et centralt lumen. Ikke-CF-organoider har en høj CI og lav IR sammenlignet med CF-organoider. ROMA-indekser diskriminerede perfekt 167 forsøgspersoner med CF fra 22 forsøgspersoner uden CF, hvilket gør ROMA til et tiltalende fysiologisk CFTR-assay til hjælp ved CF-diagnose. Rektale biopsier kan rutinemæssigt udføres i alle aldre på de fleste hospitaler, og væv kan sendes til et centralt laboratorium for organoidkultur og ROMA. I fremtiden kan ROMA også anvendes til at teste effektiviteten af CFTR-modulatorer in vitro. Formålet med denne rapport er fuldt ud at forklare de metoder, der anvendes til ROMA, for at muliggøre replikation i andre laboratorier.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv sygdom forårsaget af mutationer i CF transmembran konduktansregulator (CFTR) genet. CFTR-proteinet er en chlorid- og bicarbonatkanal, der sikrer hydrering af flere epithelia1. CF er en højbyrde, livsforkortende, multi-system sygdom, der primært manifesterer sig som en luftvejssygdom, men også påvirker mave-tarmkanalen, bugspytkirtlen, leveren og reproduktionskanalen2.
Sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer fører til et fald i mængden eller funktionen af CFTR , hvilket igen forårsager slimdehydrering. Mere end 2.000 varianter i CFTR-genet er blevet beskrevet3, hvoraf kun 466 er blevet grundigt karakteriseret4.
En diagnose af CF kan stilles, når enten svedchloridkoncentrationen (SCC) er over tærsklen på 60 mmol / L, eller når to sygdomsfremkaldende CFTR-mutationer (ifølge CFTR2-databasen) identificeres 4,5. Hos personer med kun mellemliggende forhøjet (30-60 mmol / L) SCC, som forekommer i ca. 4% -5% af svedtest6 og CFTR-mutationer af varierende eller ukendt klinisk konsekvens, kan diagnosen ikke bekræftes eller udelukkes, selv når de har CF-kompatible symptomer eller en positiv neonatal screeningstest. I disse tilfælde er anden linje fysiologiske CFTR-assays (nasal potential difference (NPD) og intestinal current measurements (ICM)) inkluderet i den diagnostiske algoritme. Disse tests er ikke let tilgængelige på de fleste centre eller gennemførlige i alle aldre, især hos spædbørn5.
Rektale organoider er 3D-strukturer dyrket af Lgr5 (+) voksne tarmstamceller fra tarmkrypter opnået gennem rektal biopsi7. Organoider anvendes i stigende grad i biomedicinsk forskning, såsom test af modulatorbehandling i CF8. En levedygtig biopsi kan opnås ved enten sugning eller pincet biopsi, en procedure, der kun forårsager minimal ubehag og er sikker selv hos spædbørn, med lave komplikationsrater9. Krypterne isoleret fra de rektale biopsier er beriget med stamceller, og under specifikke dyrkningsbetingelser organiserer disse sig selv i rektale organoider. Morfologien af disse organoider bestemmes af ekspressionen og funktionen af CFTR, der er placeret ved den apikale membran af epitelceller. Funktionel CFTR tillader klorid og vand at komme ind i organoid lumen og derved fremkalde hævelse af ikke-CF organoider. CF-organoider svulmer ikke op og har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologianalyse (ROMA) tillader forskelsbehandling mellem CF og ikke-CF organoider baseret på disse forskelle i organoid morfologi. Ikke-CF organoider er mere runde og har et synligt lumen, mens det modsatte er tilfældet for CF organoider. Til dette assay er patientspecifikke organoider belagt i 32 brønde af en 96-brøndplade. Efter 1 dags vækst farves organoiderne med calceingrøn og afbildes i et konfokalmikroskop. De ikke-CF organoider viser en mere cirkulær form og en mindre fluorescerende central del, da lumen indeholder væske og calcein pletter kun celler. Disse forskelle i morfologi kvantificeres ved hjælp af to ROMA-indekser: cirkularitetsindekset (CI) kvantificerer organoidernes rundhed, mens intensitetsforholdet (IR) er et mål for tilstedeværelsen eller fraværet af et centralt lumen. I denne rapport beskriver vi detaljeret protokollen for at opnå disse diskriminerende indekser for at muliggøre replikering af teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi leverer en detaljeret protokol til rektal organoid morfologianalyse (ROMA). De to indekser beregnet med ROMA, IR og CI, skelnede organoider fra emner med CF fra dem uden CF med perfekt nøjagtighed. ROMA kan således fungere som et nyt fysiologisk CFTR-assay, der supplerer SCC og andre aktuelt tilgængelige test13,14,15.
Protokollen er afhængig af brugen af tarmorganoider, som har en rund form og …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker de patienter og forældre, der deltog i denne undersøgelse. Vi takker Abida Bibi for alt dyrkningsarbejde med organoiderne. Vi takker Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz og Bernard Wenderickx for logistisk støtte. Vi takker også Mucovereniging/Association Muco, og specifikt Stefan Joris og Dr. Jan Vanleeuwe, for deres støtte og finansiering. Vi takker alle samarbejdspartnere fra det belgiske organoidprojekt: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgien), Linda Boulanger (Universitetshospitaler Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Bruxelles, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien), Danny De Looze (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruxelles, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruxelles), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruxelles, Belgien), Monique Lequesne (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitetshospitalet Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien), Stijn Verhulst (Universitetshospitalet Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitetshospitalet Bruxelles, Belgien).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
