Analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA): un test diagnostique dans la fibrose kystique
Summary
Ce protocole décrit l’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA), un nouveau test diagnostique de la fibrose kystique (FK). Les caractéristiques morphologiques, à savoir la rondeur (indice de circularité, IC) et la présence d’une lumière (rapport d’intensité, IR), sont une mesure de la fonction CFTR. L’analyse de 189 sujets a montré une discrimination parfaite entre les FK et les non-FC.
Abstract
Le diagnostic de la fibrose kystique (FK) n’est pas toujours simple, en particulier lorsque la concentration de chlorure dans la sueur est intermédiaire et/ou que moins de deux mutations du CFTR causant la maladie peuvent être identifiées. Des tests physiologiques CFTR (différence de potentiel nasal, mesure du courant intestinal) ont été inclus dans l’algorithme diagnostique, mais ne sont pas toujours facilement disponibles ou réalisables (p. ex. chez les nourrissons). Les organoïdes rectaux sont des structures 3D qui se développent à partir de cellules souches isolées des cryptes d’une biopsie rectale lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions spécifiques. Les organoïdes de sujets non atteints de fibrose kystique ont une forme ronde et une lumière remplie de liquide, car le transport du chlorure médié par CFTR conduit l’eau dans la lumière. Les organoïdes dont la fonction CFTR est défectueuse ne gonflent pas, conservant une forme irrégulière et n’ayant pas de lumière visible. Les différences de morphologie entre les organoïdes FK et non FK sont quantifiées dans l’analyse de la morphologie des organoïdes rectaux (ROMA) en tant que nouveau test physiologique CFTR. Pour le test ROMA, les organoïdes sont plaqués dans des plaques à 96 puits, colorés avec de la calcéine et imagés au microscope confocal. Les différences morphologiques sont quantifiées à l’aide de deux indices : l’indice de circularité (IC) quantifie la rondeur des organoïdes, et le rapport d’intensité (IR) est une mesure de la présence d’une lumière centrale. Les organoïdes non-FK ont un IC élevé et un IR faible par rapport aux organoïdes de la FK. Les index ROMA ont parfaitement discriminé 167 sujets atteints de mucoviscidose de 22 sujets sans mucoviscidose, ce qui fait de la ROMA un test physiologique CFTR attrayant pour aider au diagnostic de la mucoviscidose. Les biopsies rectales peuvent être effectuées systématiquement à tous les âges dans la plupart des hôpitaux et les tissus peuvent être envoyés à un laboratoire central pour la culture organoïde et la ROMA. À l’avenir, la ROMA pourrait également être appliquée pour tester l’efficacité des modulateurs CFTR in vitro. L’objectif du présent rapport est d’expliquer en détail les méthodes utilisées pour ROMA, afin de permettre la reproduction dans d’autres laboratoires.
Introduction
La fibrose kystique (FK) est une maladie autosomique récessive causée par des mutations du gène régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR). La protéine CFTR est un canal chlorure et bicarbonate, assurant l’hydratation de plusieurs épithéliums1. La FK est une maladie multisystémique à charge de morbidité élevée, qui raccourcit la vie, qui se manifeste principalement par une maladie respiratoire, mais qui affecte également le tractus gastro-intestinal, le pancréas, le foie et l’appareil reproducteur2.
Les mutations du CFTR causant la maladie entraînent une diminution de la quantité ou de la fonction de CFTR , provoquant à son tour une déshydratation du mucus. Plus de 2 000 variantes du gène CFTR ont été décrites3, dont seulement 466 ont été caractérisées de manière approfondie4.
Un diagnostic de FK peut être posé lorsque la concentration de chlorure dans la sueur (CSC) est supérieure au seuil de 60 mmol/L ou lorsque deux mutations du CFTR causant la maladie (selon la base de données CFTR2) sont identifiées 4,5. Chez les sujets présentant seulement un CSC moyennement élevé (30-60 mmol / L), qui se produit dans environ 4% à 5% des tests de sueur6, et des mutations CFTR de conséquence clinique variable ou inconnue, le diagnostic ne peut être confirmé ni exclu, même s’ils présentent des symptômes compatibles avec la FK ou un test de dépistage néonatal positif. Pour ces cas, des tests physiologiques CFTR de deuxième intention (différence de potentiel nasal (NPD) et mesures de courant intestinal (ICM)) ont été inclus dans l’algorithme de diagnostic. Ces tests ne sont pas facilement disponibles dans la plupart des centres ni réalisables à tous les âges, en particulier chez les nourrissons5.
Les organoïdes rectaux sont des structures 3D cultivées à partir de cellules souches intestinales adultes Lgr5(+) provenant de cryptes intestinales obtenues par biopsie rectale7. Les organoïdes sont de plus en plus utilisés dans la recherche biomédicale, comme l’essai d’un traitement modulateur dans la FC8. Une biopsie viable peut être obtenue par aspiration ou par forcepsie, une procédure qui ne provoque qu’un inconfort minimal et qui est sûre même chez les nourrissons, avec de faibles taux de complications9. Les cryptes isolées des biopsies rectales sont enrichies en cellules souches et, dans des conditions de culture spécifiques, celles-ci s’auto-organisent en organoïdes rectaux. La morphologie de ces organoïdes est déterminée par l’expression et la fonction du CFTR, situé au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales. Le CFTR fonctionnel permet au chlorure et à l’eau de pénétrer dans la lumière organoïde, induisant ainsi un gonflement des organoïdes non CF. Les organoïdes de la mucoviscidose ne gonflent pas et n’ont pas de lumière visible10,11.
L’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA) permet la discrimination entre les organoïdes FK et non FK en fonction de ces différences de morphologie organoïde. Les organoïdes non-FK sont plus ronds et ont une lumière visible, alors que l’inverse est vrai pour les organoïdes FK. Pour ce test, les organoïdes spécifiques au patient sont plaqués dans 32 puits d’une plaque de 96 puits. Après 1 jour de croissance, les organoïdes sont colorés au vert de calcéine et imagés au microscope confocal. Les organoïdes non-CF montrent une forme plus circulaire et une partie centrale moins fluorescente, car la lumière contient du liquide et la calcéine ne colore que les cellules. Ces différences de morphologie sont quantifiées à l’aide de deux indices ROMA : l’indice de circularité (IC) quantifie la rondeur des organoïdes, tandis que le rapport d’intensité (IR) est une mesure de la présence ou de l’absence d’une lumière centrale. Dans ce rapport, nous décrivons en détail le protocole pour obtenir ces indices discriminatifs, afin de permettre la réplication de la technique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous fournissons un protocole détaillé pour l’analyse de la morphologie organoïde rectale (ROMA). Les deux indices calculés avec ROMA, IR et CI ont distingué les organoïdes des sujets atteints de mucoviscidose de ceux sans mucoviscidose avec une précision parfaite. ROMA pourrait donc fonctionner comme un nouveau test physiologique CFTR complémentaire au CSC et à d’autres tests actuellement disponibles13,14,15.
<…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les patients et les parents qui ont participé à cette étude. Nous remercions Abida Bibi pour tout le travail de culture avec les organoïdes. Nous remercions Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz et Bernard Wenderickx pour leur soutien logistique. Nous remercions également le Mucovereniging/Association Muco, et en particulier Stefan Joris et Dr. Jan Vanleeuwe, pour leur soutien et leur financement. Nous remercions tous les collaborateurs du Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgique), Linda Boulanger (Hôpitaux Universitaires de Louvain, Belgique), Georges Casimir (HUDERF, Bruxelles, Belgique), Benedicte De Meyere (Hôpital Universitaire de Gand, Belgique), Elke De Wachter (Hôpital Universitaire de Bruxelles, Belgique), Danny De Looze (Hôpital Universitaire de Gand, Belgique), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruxelles, Belgique), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruxelles), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruxelles, Belgique), Monique Lequesne (Hôpital universitaire d’Anvers, Belgique), Vicky Nowé (GZA Hôpital Saint-Vincentius Anvers), Dirk Staessen (GZA Hôpital Saint-Vincentius Anvers), Stephanie Van Biervliet (Hôpital universitaire de Gand, Belgique), Eva Van Braeckel (Hôpital universitaire de Gand, Belgique), Kim Van Hoorenbeeck (Hôpital universitaire d’Anvers, Belgique), Eef Vanderhelst (Hôpital universitaire de Bruxelles, Belgique), Stijn Verhulst (Hôpital universitaire d’Anvers, Belgique), Stefanie Vincken (Hôpital Universitaire de Bruxelles, Belgique).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
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