Rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA): Ein diagnostischer Assay bei Mukoviszidose
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA), einen neuartigen diagnostischen Assay für Mukoviszidose (CF). Morphologische Merkmale, nämlich die Rundheit (Zirkularitätsindex, CI) und das Vorhandensein eines Lumens (Intensitätsverhältnis, IR), sind ein Maß für die CFTR-Funktion. Die Analyse von 189 Probanden zeigte eine perfekte Unterscheidung zwischen CF und Nicht-CF.
Abstract
Die Diagnose einer Mukoviszidose (CF) ist nicht immer einfach, insbesondere wenn die Schweißchloridkonzentration intermediär ist und/oder weniger als zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen identifiziert werden können. Physiologische CFTR-Assays (nasale Potentialdifferenz, Darmstrommessung) wurden in den diagnostischen Algorithmus aufgenommen, sind aber nicht immer leicht verfügbar oder durchführbar (z. B. bei Säuglingen). Rektale Organoide sind 3D-Strukturen, die aus Stammzellen wachsen, die aus Krypten einer rektalen Biopsie isoliert wurden, wenn sie unter bestimmten Bedingungen kultiviert werden. Organoide von Nicht-CF-Probanden haben eine runde Form und ein flüssigkeitsgefülltes Lumen, da CFTR-vermittelter Chloridtransport Wasser in das Lumen treibt. Organoide mit defekter CFTR-Funktion quellen nicht an, behalten eine unregelmäßige Form und haben kein sichtbares Lumen. Unterschiede in der Morphologie zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden werden in der ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) als neuartiger CFTR-physiologischer Assay quantifiziert. Für den ROMA-Assay werden Organoide in 96-Well-Platten plattiert, mit Calcein gefärbt und in einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Morphologische Unterschiede werden anhand von zwei Indizes quantifiziert: Der Zirkularitätsindex (CI) quantifiziert die Rundheit von Organoiden, und das Intensitätsverhältnis (IR) ist ein Maß für das Vorhandensein eines zentralen Lumens. Nicht-CF-Organoide haben im Vergleich zu CF-Organoiden ein hohes CI und einen niedrigen IR. ROMA indiziert perfekt 167 Probanden mit CF von 22 Probanden ohne CF, was ROMA zu einem ansprechenden physiologischen CFTR-Assay zur Unterstützung der CF-Diagnose macht. Rektale Biopsien können routinemäßig in jedem Alter in den meisten Krankenhäusern durchgeführt werden, und Gewebe kann an ein zentrales Labor für Organoidkultur und ROMA geschickt werden. In Zukunft könnte ROMA auch angewendet werden, um die Wirksamkeit von CFTR-Modulatoren in vitro zu testen. Das Ziel des vorliegenden Berichts ist es, die für ROMA verwendeten Methoden vollständig zu erklären, um die Replikation in anderen Labors zu ermöglichen.
Introduction
Mukoviszidose (CF) ist eine autosomal-rezessive Erkrankung, die durch Mutationen im CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulatorgen (CFTR) verursacht wird. Das CFTR-Protein ist ein Chlorid- und Bikarbonatkanal, der die Hydratation mehrerer Epithelien gewährleistet1. CF ist eine hochbelastete, lebensverkürzende, multisystemische Erkrankung, die sich in erster Linie als Atemwegserkrankung manifestiert, aber auch den Magen-Darm-Trakt, die Bauchspeicheldrüse, die Leber und den Fortpflanzungstrakt betrifft2.
Krankheitsverursachende CFTR-Mutationen führen zu einer Abnahme der Menge oder Funktion von CFTR , was wiederum zu Schleimdehydrierung führt. Mehr als 2.000 Varianten im CFTR-Gen wurden beschrieben3, von denen nur 466 gründlich charakterisiert wurden4.
Eine Diagnose von CF kann gestellt werden, wenn entweder die Schweißchloridkonzentration (SCC) über dem Schwellenwert von 60 mmol/L liegt oder wenn zwei krankheitsverursachende CFTR-Mutationen (gemäß der CFTR2-Datenbank) identifiziert werden 4,5. Bei Patienten mit nur mittelstark erhöhtem (30-60 mmol/L) SCC, das bei etwa 4%-5% der Schweißtests auftritt6, und CFTR-Mutationen unterschiedlicher oder unbekannter klinischer Konsequenz kann die Diagnose weder bestätigt noch ausgeschlossen werden, selbst wenn sie CF-kompatible Symptome oder einen positiven neonatalen Screening-Test haben. Für diese Fälle wurden physiologische Second-Line-CFTR-Assays (Nasale Potential Difference (NPD) und Darmstrommessungen (ICM)) in den Diagnosealgorithmus aufgenommen. Diese Tests sind in den meisten Zentren nicht ohne weiteres verfügbar und auch nicht in jedem Alter durchführbar, insbesondere bei Säuglingen5.
Rektale Organoide sind 3D-Strukturen, die aus Lgr5(+) adulten Darmstammzellen aus Darmkrypten gezüchtet werden, die durch Rektalbiopsie gewonnen werden7. Organoide werden zunehmend in der biomedizinischen Forschung eingesetzt, etwa bei der Testung der Modulatorbehandlung bei CF8. Eine lebensfähige Biopsie kann entweder durch Absaugen oder Zangenbiopsie erreicht werden, ein Verfahren, das nur minimale Beschwerden verursacht und selbst bei Säuglingen mit niedrigen Komplikationsraten sicher ist9. Die aus den rektalen Biopsien isolierten Krypten werden in Stammzellen angereichert, und unter bestimmten Kulturbedingungen organisieren sich diese selbst zu rektalen Organoiden. Die Morphologie dieser Organoide wird durch die Expression und Funktion von CFTR bestimmt, das sich an der apikalen Membran von Epithelzellen befindet. Funktionelle CFTR lässt Chlorid und Wasser in das Organoidlumen eindringen, wodurch eine Quellung von Nicht-CF-Organoiden induziert wird. CF-Organoide quellen nicht an und haben kein sichtbares Lumen10,11.
Die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA) ermöglicht die Unterscheidung zwischen CF- und Nicht-CF-Organoiden basierend auf diesen Unterschieden in der Organoidmorphologie. Nicht-CF-Organoide sind runder und haben ein sichtbares Lumen, während das Gegenteil für CF-Organoide gilt. Für diesen Assay werden patientenspezifische Organoide in 32 Vertiefungen einer 96-Well-Platte plattiert. Nach 1 Tag des Wachstums werden die Organoide mit Calceingrün gefärbt und in einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Die Nicht-CF-Organoide zeigen eine kreisförmigere Form und einen weniger fluoreszierenden zentralen Teil, da das Lumen Flüssigkeit enthält und Calcein nur Zellen färbt. Diese Unterschiede in der Morphologie werden mit zwei ROMA-Indizes quantifiziert: Der Zirkularitätsindex (CI) quantifiziert die Rundheit von Organoiden, während das Intensitätsverhältnis (IR) ein Maß für das Vorhandensein oder Fehlen eines zentralen Lumens ist. In diesem Bericht beschreiben wir detailliert das Protokoll, um diese diskriminativen Indizes zu erhalten, um die Replikation der Technik zu ermöglichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die rektale Organoidmorphologieanalyse (ROMA) zur Verfügung. Die beiden mit ROMA, IR und CI berechneten Indizes unterschieden Organoide von Probanden mit CF von denen ohne CF mit perfekter Genauigkeit. ROMA könnte somit als neuartiger physiologischer CFTR-Assay fungieren, der SCC und andere derzeit verfügbare Testsergänzt 13,14,15.
Das Protokoll ist abh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Patienten und Eltern, die an dieser Studie teilgenommen haben. Wir danken Abida Bibi für alle Kultivierungsarbeiten mit den Organoiden. Wir danken Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz und Bernard Wenderickx für die logistische Unterstützung. Wir danken auch der Mucovereniging/Association Muco, insbesondere Stefan Joris und Dr. Jan Vanleeuwe, für ihre Unterstützung und Finanzierung. Wir danken allen Mitarbeitern des Belgian Organoid Project: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Lüttich, Belgien), Linda Boulanger (Universitätskliniken Leuven, Belgien), Georges Casimir (HUDERF, Brüssel, Belgien), Benedicte De Meyere (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Elke De Wachter (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien), Danny De Looze (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brüssel, Belgien), Laurence Hanssens (HUDERF, Brüssel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brüssel, Belgien), Monique Lequesne (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Eva Van Braeckel (Universitätsklinikum Gent, Belgien), Kim Van Hoorenbeeck (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Eef Vanderhelst (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien), Stijn Verhulst (Universitätsklinikum Antwerpen, Belgien), Stefanie Vincken (Universitätsklinikum Brüssel, Belgien).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
