रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा): सिस्टिक फाइब्रोसिस में एक नैदानिक परख
Summary
यह प्रोटोकॉल रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा) का वर्णन करता है, जो सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) के लिए एक नया नैदानिक परख है। रूपात्मक विशेषताएं, अर्थात् गोलाई (परिपत्रता सूचकांक, सीआई) और लुमेन (तीव्रता अनुपात, आईआर) की उपस्थिति, सीएफटीआर फ़ंक्शन का एक उपाय है। 189 विषयों के विश्लेषण ने सीएफ और गैर-सीएफ के बीच सही भेदभाव दिखाया।
Abstract
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) का निदान हमेशा सीधा नहीं होता है, खासकर जब पसीने क्लोराइड एकाग्रता मध्यवर्ती होती है और / या दो से कम रोग पैदा करने वाले सीएफटीआर उत्परिवर्तन की पहचान की जा सकती है। फिजियोलॉजिकल सीएफटीआर परख (नाक संभावित अंतर, आंतों का वर्तमान माप) नैदानिक एल्गोरिथ्म में शामिल किया गया है, लेकिन हमेशा आसानी से उपलब्ध या व्यवहार्य नहीं होता है (उदाहरण के लिए, शिशुओं में)। रेक्टल ऑर्गेनोइड ्स 3 डी संरचनाएं हैं जो विशिष्ट परिस्थितियों में सुसंस्कृत होने पर रेक्टल बायोप्सी के क्रिप्ट से अलग स्टेम कोशिकाओं से बढ़ती हैं। गैर-सीएफ विषयों के ऑर्गेनोइड्स में एक गोल आकार और एक तरल पदार्थ से भरा लुमेन होता है, क्योंकि सीएफटीआर-मध्यस्थता क्लोराइड परिवहन लुमेन में पानी चलाता है। दोषपूर्ण सीएफटीआर फ़ंक्शन वाले ऑर्गेनोइड्स फूलते नहीं हैं, अनियमित आकार को बनाए रखते हैं और कोई दृश्यमान लुमेन नहीं होता है। सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स के बीच आकृति विज्ञान में अंतर को ‘रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण’ (रोमा) में एक उपन्यास सीएफटीआर शारीरिक परख के रूप में निर्धारित किया गया है। रोमा परख के लिए, ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेटों में चढ़ाया जाता है, कैल्सीन से दाग दिया जाता है, और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में चित्रित किया जाता है। रूपात्मक अंतर को दो सूचकांकों का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है: परिपत्रता सूचकांक (सीआई) ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, और तीव्रता अनुपात (आईआर) एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति का एक उपाय है। सीएफ ऑर्गेनोइड्स की तुलना में गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स में उच्च सीआई और कम आईआर होता है। रोमा इंडेक्स ने सीएफ के बिना 22 विषयों से सीएफ के साथ 167 विषयों को पूरी तरह से भेदभाव किया, जिससे रोमा सीएफ निदान में सहायता के लिए एक आकर्षक शारीरिक सीएफटीआर परख बन गया। रेक्टल बायोप्सी को अधिकांश अस्पतालों में सभी उम्र में नियमित रूप से किया जा सकता है और ऊतक को ऑर्गेनॉइड कल्चर और रोमा के लिए एक केंद्रीय प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है। भविष्य में, ROMA को विट्रो में CFTR मॉड्यूलेटर की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। वर्तमान रिपोर्ट का उद्देश्य रोमा के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों को पूरी तरह से समझाना है, ताकि अन्य प्रयोगशालाओं में प्रतिकृति की अनुमति मिल सके।
Introduction
सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) एक ऑटोसोमल रिसेसिव बीमारी है जो सीएफ ट्रांसमेम्ब्रेन चालकता नियामक (सीएफटीआर) जीन में उत्परिवर्तन के कारण होती है। सीएफटीआर प्रोटीन एक क्लोराइड और बाइकार्बोनेट चैनल है, जो कई एपिथेलिया1 के जलयोजन को सुनिश्चित करता है। सीएफ एक उच्च बोझ, जीवन-छोटा, बहु-प्रणाली रोग है, जो मुख्य रूप से श्वसन रोग के रूप में प्रकट होता है, लेकिन जठरांत्र संबंधी मार्ग, अग्न्याशय, यकृत और प्रजनन पथ को भी प्रभावित करताहै।
रोग पैदा करने वाले सीएफटीआर उत्परिवर्तन सीएफटीआर की मात्रा या कार्य में कमी का कारण बनते हैं, बदले में बलगम निर्जलीकरण का कारण बनते हैं। सीएफटीआर जीन में 2,000 से अधिक वेरिएंट को3 वर्णित किया गया है, जिनमें से केवल 466 को पूरी तरह सेचित्रित किया गया है।
सीएफ का निदान तब किया जा सकता है जब या तो पसीना क्लोराइड एकाग्रता (एससीसी) 60 mmol / L की सीमा से ऊपर हो या जब दो रोग पैदा करने वाले CFTR उत्परिवर्तन (CFTR2 डेटाबेस के अनुसार) की पहचान की जाती है। केवल मध्यवर्ती रूप से ऊंचा (30-60 mmol / L) एससीसी वाले विषयों में, जो पसीनेके परीक्षणों के लगभग 4% -5% में होता है, और अलग-अलग या अज्ञात नैदानिक परिणाम के CFTR उत्परिवर्तन, निदान की पुष्टि नहीं की जा सकती है और न ही इनकार किया जा सकता है, भले ही उनके पास सीएफ संगत लक्षण हों या सकारात्मक नवजात स्क्रीनिंग परीक्षण हो। इन मामलों के लिए, दूसरी पंक्ति के शारीरिक सीएफटीआर परख (नाक संभावित अंतर (एनपीडी) और आंतों के वर्तमान माप (आईसीएम)) को नैदानिक एल्गोरिथ्म में शामिल किया गया है। ये परीक्षण अधिकांश केंद्रों पर आसानी से उपलब्ध नहीं हैं और न ही सभी उम्र मेंसंभव हैं, खासकर शिशुओं में।
रेक्टल ऑर्गेनोइड्स 3 डी संरचनाएं हैं जो एलजीआर 5 (+) वयस्क आंतों की स्टेम कोशिकाओं से विकसित होती हैं जो रेक्टल बायोप्सी 7 के माध्यम से प्राप्त आंतों के क्रिप्ट सेहोती हैं। बायोमेडिकल अनुसंधान में ऑर्गेनोइड्स का तेजी से उपयोग किया जा रहा है, जैसे कि सीएफ8 में मॉड्यूलेटर उपचार का परीक्षण। एक व्यवहार्य बायोप्सी या तो सक्शन या फोर्सप्स बायोप्सी द्वारा प्राप्त की जा सकती है, एक ऐसी प्रक्रिया जो केवल न्यूनतम असुविधा का कारण बनती है और शिशुओं में भी सुरक्षित है, कम जटिलता दरके साथ 9. रेक्टल बायोप्सी से अलग किए गए क्रिप्ट्स स्टेम कोशिकाओं में समृद्ध होते हैं, और विशिष्ट संवर्धन स्थितियों के तहत, ये रेक्टल ऑर्गेनोइड्स में स्वयं व्यवस्थित होते हैं। इन ऑर्गेनोइड्स की आकृति विज्ञान सीएफटीआर की अभिव्यक्ति और कार्य द्वारा निर्धारित किया जाता है, जो उपकला कोशिकाओं के एपिकल झिल्ली पर स्थित है। कार्यात्मक सीएफटीआर क्लोराइड और पानी को ऑर्गेनॉइड लुमेन में प्रवेश करने की अनुमति देता है, जिससे गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड्स की सूजन उत्पन्न होती है। सीएफ ऑर्गेनोइड्स सूज नहीं जाते हैं और इसमें कोई दृश्यमान लुमेन10,11 नहीं होता है।
रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (रोमा) ऑर्गेनोइड आकृति विज्ञान में इन अंतरों के आधार पर सीएफ और गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड अधिक गोल होते हैं और इसमें एक दृश्यमान लुमेन होता है, जबकि सीएफ ऑर्गेनोइड्स के लिए विपरीत सच है। इस परख के लिए, रोगी-विशिष्ट ऑर्गेनोइड्स को 96-वेल प्लेट के 32 कुओं में चढ़ाया जाता है। बढ़ने के 1 दिन के बाद, ऑर्गेनोइड्स को कैल्सीन हरे रंग से दाग दिया जाता है और एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में चित्रित किया जाता है। गैर-सीएफ ऑर्गेनोइड एक अधिक गोलाकार आकार और कम फ्लोरोसेंट केंद्रीय भाग दिखाते हैं, क्योंकि लुमेन में तरल पदार्थ और कैल्सीन के दाग केवल कोशिकाएं होती हैं। आकृति विज्ञान में इन अंतरों को दो रोमा इंडेक्स का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है: परिपत्रता सूचकांक (सीआई) ऑर्गेनोइड्स की गोलाई को निर्धारित करता है, जबकि तीव्रता अनुपात (आईआर) एक केंद्रीय लुमेन की उपस्थिति या अनुपस्थिति का एक उपाय है। इस रिपोर्ट में, हम तकनीक की प्रतिकृति की अनुमति देने के लिए, इन भेदभावपूर्ण सूचकांकों को प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम रेक्टल ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान विश्लेषण (ROMA) के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। रोमा, आईआर और सीआई के साथ गणना किए गए दो इंडेक्स, सीएफ के साथ विषयों से ऑर्गेनोइड्स को सही सटीकता के साथ सीएफ क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस अध्ययन में भाग लेने वाले रोगियों और माता-पिता को धन्यवाद देते हैं। हम आबिदा बीबी को ऑर्गेनोइड्स के साथ सभी संवर्धन कार्यों के लिए धन्यवाद देते हैं। हम एल्स एर्टगर्ट्स, कैरोलीन ब्रुनेल, क्लेयर कोलार्ड, लिलियन कोलिग्नन, मोनिक डेलफॉस, अंजा डेलपोर्ट, नथाली फेयर्स, सेसिले लैम्ब्रेमोंट, लुट नीयूबोर्ग, नथाली पीटर्स, एन रमन, पिम सैनसेन, हिल्डे स्टीवंस, मैरिएन शूल्टे, एल्स वान रैंसबेक, क्रिस्टेल वैन डी ब्रांडे, ग्रीट वैन डेन आइंडे, मार्लिन वेंडरकेन, इंगे वैन डिज्क, ऑड्रे वेंडरकेन, इंगे वैन डिज्क, और बर्नार्ड वेंडर, वेंडरी वेंडर, मोनिका वासिके का शुक्रिया अदा करते हैं। एसोसिएशन म्यूको, और विशेष रूप से स्टीफन जोरिस और डॉ जान वानल्यूवे को उनके समर्थन और वित्तपोषण के लिए धन्यवाद देते हैं। हम बेल्जियम ऑर्गेनॉइड प्रोजेक्ट के सभी सहयोगियों को धन्यवाद देते हैं: हेडविगे बोबोली (सीएचआर सिटाडेल, लीज, बेल्जियम), लिंडा बाउलंगर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल्स ल्यूवेन, बेल्जियम), जॉर्जेस कैसिमिर (एचयूडीईआरएफ, ब्रुसेल्स, बेल्जियम), बेनेडिक्ट डी मेयर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), एल्के डी वाच्टर (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम), डैनी डी लूज़ (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), इसाबेल एटिने (सीएचयू इरास्मे, ब्रसेल्स, बेल्जियम), लॉरेंस हैंसेन्स ब्रसेल्स, क्रिस्टियन नोप (सीयू इरास्मे, ब्रसेल्स, बेल्जियम), मोनिक लेक्वेस्ने (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एंटवर्प, बेल्जियम), विक्की नोवे (जीजेडए सेंट विंसेंटियस हॉस्पिटल एंटवर्प), डिर्क स्टेसेन (जीजेडए सेंट विंसेंटियस हॉस्पिटल एंटवर्प), स्टेफनी वान बिएर्लेट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), ईवा वैन ब्रैकेल (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल गेंट, बेल्जियम), किम वान होरेनबेक (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल एंटवर्प, बेल्जियम), ईफ वेंडरहेल्स्ट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम), ईफ वेंडरहेल्स्ट (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम) बेल्जियम), स्टेफनी विन्केन (यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल ब्रसेल्स, बेल्जियम)।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
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