Rektal organoid morfologi analyse (ROMA): En diagnostisk analyse i cystisk fibrose
Summary
Denne protokollen beskriver rektal organoid morfologi analyse (ROMA), en ny diagnostisk analyse for cystisk fibrose (CF). Morfologiske egenskaper, nemlig rundheten (sirkularitetsindeks, CI) og tilstedeværelsen av et lumen (intensitetsforhold, IR), er et mål på CFTR-funksjonen. Analyse av 189 forsøkspersoner viste perfekt diskriminering mellom CF og ikke-CF.
Abstract
Diagnosen cystisk fibrose (CF) er ikke alltid enkel, spesielt når konsentrasjonen av svetteklorid er middels og/eller mindre enn to sykdomsfremkallende mutasjoner av CFTR kan identifiseres. Fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell, måling av tarmstrøm) er inkludert i den diagnostiske algoritmen, men er ikke alltid lett tilgjengelige eller gjennomførbare (f.eks. hos spedbarn). Rektale organoider er 3D-strukturer som vokser fra stamceller isolert fra krypter av en rektal biopsi når de dyrkes under spesifikke forhold. Organoider fra ikke-CF-personer har en rund form og et væskefylt lumen, da CFTR-mediert kloridtransport driver vann inn i lumen. Organoider med defekt CFTR-funksjon svulmer ikke, beholder en uregelmessig form og har ingen synlig lumen. Forskjeller i morfologi mellom CF og ikke-CF organoider er kvantifisert i ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) som en ny CFTR fysiologisk analyse. For ROMA-analysen er organoider belagt i 96-brønnplater, farget med calcein og avbildet i et konfokalt mikroskop. Morfologiske forskjeller kvantifiseres ved hjelp av to indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, og intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen av et sentralt lumen. Ikke-CF-organoider har høy KI og lav IR sammenlignet med CF-organoider. ROMA-indekser diskriminerte perfekt 167 personer med CF fra 22 personer uten CF, noe som gjorde ROMA til en tiltalende fysiologisk CFTR-analyse for å hjelpe til med CF-diagnose. Rektale biopsier kan rutinemessig utføres i alle aldre på de fleste sykehus, og vev kan sendes til et sentralt laboratorium for organoidkultur og ROMA. I fremtiden kan ROMA også brukes til å teste effekten av CFTR-modulatorer in vitro. Målet med denne rapporten er å fullt ut forklare metodene som brukes for ROMA, for å tillate replikering i andre laboratorier.
Introduction
Cystisk fibrose (CF) er en autosomal recessiv sykdom forårsaket av mutasjoner i CF transmembran konduktansregulator (CFTR) genet. CFTR-proteinet er en klorid- og bikarbonatkanal, noe som sikrer hydrering av flere epitel1. CF er en høybelastende, livsforkortende, multisystemsykdom, som først og fremst manifesterer seg som en luftveissykdom, men påvirker også mage-tarmkanalen, bukspyttkjertelen, leveren og reproduktive kanalen2.
Sykdomsfremkallende mutasjoner i CFTR fører til en reduksjon i mengden eller funksjonen av CFTR, noe som igjen forårsaker dehydrering av slim. Mer enn 2000 varianter i CFTR-genet er beskrevet3, hvorav bare 466 har blitt grundig karakterisert4.
En diagnose av CF kan gjøres når enten svettekloridkonsentrasjonen (SCC) er over terskelen på 60 mmol / L eller når to sykdomsfremkallende CFTR-mutasjoner (ifølge CFTR2-databasen) er identifisert 4,5. Hos personer med bare middels forhøyet (30-60 mmol / L) SCC, som forekommer i ca. 4% -5% av svettetester6, og CFTR-mutasjoner av varierende eller ukjent klinisk konsekvens, kan diagnosen ikke bekreftes eller utelukkes, selv når de har CF-kompatible symptomer eller en positiv neonatal screeningstest. For disse tilfellene har andrelinje fysiologiske CFTR-analyser (nasal potensialforskjell (NPD) og tarmstrømmålinger (ICM)) blitt inkludert i den diagnostiske algoritmen. Disse testene er ikke lett tilgjengelige på de fleste sentre og heller ikke gjennomførbare i alle aldre, spesielt hos spedbarn5.
Rektale organoider er 3D-strukturer dyrket fra Lgr5 (+) voksne intestinale stamceller fra tarmkrypter oppnådd gjennom rektal biopsi7. Organoider brukes i økende grad i biomedisinsk forskning, for eksempel testing av modulatorbehandling i CF8. En levedyktig biopsi kan oppnås ved enten suge- eller tangbiopsi, en prosedyre som bare forårsaker minimal ubehag og er trygg selv hos spedbarn, med lave komplikasjonsrater9. Kryptene isolert fra rektalbiopsiene er beriket i stamceller, og under spesifikke dyrkingsforhold organiserer disse seg selv i rektalorganoider. Morfologien til disse organoider bestemmes av uttrykket og funksjonen til CFTR, lokalisert ved den apikale membranen av epitelceller. Funksjonell CFTR tillater klorid og vann å komme inn i organoidlumen, og derved indusere hevelse av ikke-CF-organoider. CF-organoider svulmer ikke og har ingen synlig lumen10,11.
Rektal organoid morfologi analyse (ROMA) tillater diskriminering mellom CF og ikke-CF organoider basert på disse forskjellene i organoid morfologi. Ikke-CF-organoider er mer runde og har et synlig lumen, mens det motsatte er tilfelle for CF-organoider. For denne analysen er pasientspesifikke organoider belagt i 32 brønner i en 96-brønnplate. Etter 1 dag med dyrking, er organoider farget med calcein grønn og avbildet i et konfokalt mikroskop. De ikke-CF-organoider viser en mer sirkulær form og en mindre fluorescerende sentral del, da lumen inneholder væske og calcein flekker bare celler. Disse forskjellene i morfologi kvantifiseres ved hjelp av to ROMA-indekser: Sirkularitetsindeksen (CI) kvantifiserer rundheten til organoider, mens intensitetsforholdet (IR) er et mål på tilstedeværelsen eller fraværet av et sentralt lumen. I denne rapporten beskriver vi i detalj protokollen for å oppnå disse diskriminerende indeksene, for å tillate replikering av teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi gir en detaljert protokoll for rektal organoid morfologi analyse (ROMA). De to indeksene beregnet med ROMA, IR og CI, skilte organoider fra personer med CF fra de uten CF med perfekt nøyaktighet. ROMA kan dermed fungere som en ny fysiologisk CFTR-analyse komplementær til SCC og andre tilgjengelige tester13,14,15.
Protokollen er avhengig av bruk av tarmorganoider, som har en rund form og sentral l…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker pasienter og foreldre som deltok i denne studien. Vi takker Abida Bibi for alt kulturarbeid med organoidene. Vi takker Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz og Bernard Wenderickx for logistikkstøtte. Vi takker også Mucovereniging / Association Muco, og spesielt Stefan Joris og Dr. Jan Vanleeuwe, for deres støtte og finansiering. Vi takker alle samarbeidspartnere fra det belgiske organoidprosjektet: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Liège, Belgia), Linda Boulanger (Universitetssykehusene Leuven, Belgia), Georges Casimir (HUDERF, Brussel, Belgia), Benedicte De Meyere (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Elke De Wachter (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Danny De Looze (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Laurence Hanssens (HUDERF, Brussel), Christiane Knoop (CHU Erasme, Brussel, Belgia), Monique Lequesne (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerpen), Stephanie Van Biervliet (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Eva Van Braeckel (Universitetssykehuset Gent, Belgia), Kim Van Hoorenbeeck (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Eef Vanderhelst (Universitetssykehuset Brussel, Belgia), Stijn Verhulst (Universitetssykehuset Antwerpen, Belgia), Stefanie Vincken (Universitetssykehuset Brussel, Belgia).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
