Анализ морфологии органоидов прямой кишки (ROMA): диагностический анализ при муковисцидозе
Summary
Этот протокол описывает анализ морфологии ректальных органоидов (ROMA), новый диагностический анализ муковисцидоза (МВ). Морфологические характеристики, а именно округлость (индекс циркулярности, CI) и наличие светового потока (коэффициент интенсивности, IR), являются мерой функции CFTR. Анализ 189 испытуемых показал идеальную дискриминацию между муковисцидозом и без муковисцидоза.
Abstract
Диагностика муковисцидоза (МВ) не всегда проста, особенно когда концентрация хлорида пота является промежуточной и/или менее двух болезнетворных мутаций CFTR . Физиологические анализы CFTR (разность носовых потенциалов, измерение кишечного тока) были включены в диагностический алгоритм, но не всегда легко доступны или осуществимы (например, у младенцев). Ректальные органоиды представляют собой 3D-структуры, которые растут из стволовых клеток, выделенных из крипт ректальной биопсии при культивировании в определенных условиях. Органоиды у субъектов, не страдающих CF, имеют круглую форму и заполненный жидкостью просвет, поскольку Опосредованный CFTR транспорт хлоридов приводит воду в просвет. Органоиды с дефектной функцией CFTR не набухают, сохраняя неправильную форму и не имея видимого просвета. Различия в морфологии между органоидами МВ и без МВ количественно определены в «Анализе морфологии ректальных органоидов» (ROMA) в качестве нового физиологического анализа CFTR. Для анализа ROMA органоиды покрываются 96-луночными пластинами, окрашиваются кальцеином и визуализируются в конфокальном микроскопе. Морфологические различия количественно оцениваются с использованием двух индексов: индекс циркулярности (CI) количественно определяет округлость органоидов, а коэффициент интенсивности (IR) является мерой наличия центрального просвета. Органоиды, не относящиеся к CF, имеют высокий CI и низкий IR по сравнению с органоидами CF. Индексы ROMA идеально различали 167 субъектов с муковисцидозом из 22 субъектов без муковисцидоза, что делает ROMA привлекательным физиологическим анализом CFTR, помогающим в диагностике муковисцидоза. Ректальные биопсии могут регулярно выполняться в любом возрасте в большинстве больниц, а ткани могут быть отправлены в центральную лабораторию для культуры органоидов и ROMA. В будущем ROMA может также применяться для проверки эффективности модуляторов CFTR in vitro. Цель настоящего доклада состоит в том, чтобы полностью разъяснить методы, используемые для РОМА, с тем чтобы можно было воспроизвести их в других лабораториях.
Introduction
Муковисцидоз (CF) является аутосомно-рецессивным заболеванием, вызванным мутациями в гене трансмембранного регулятора проводимости CF (CFTR). Белок CFTR представляет собой хлоридно-бикарбонатный канал, обеспечивающий гидратацию нескольких эпителий1. Муковисцидоз является тяжелым, укорачивающим жизнь, многосистемным заболеванием, проявляющимся в первую очередь как респираторное заболевание, но также поражающим желудочно-кишечный тракт, поджелудочную железу, печень и репродуктивный тракт2.
Болезнетворные мутации CFTR приводят к уменьшению количества или функции CFTR, что, в свою очередь, вызывает обезвоживание слизи. Более 2000 вариантов гена CFTR были описаны3, из которых только 466 были тщательно охарактеризованы4.
Диагноз МВ может быть поставлен, когда концентрация хлорида пота (SCC) выше порога 60 ммоль/л или когда выявлены две болезнетворные мутации CFTR (согласно базе данных CFTR2) 4,5. У субъектов с только промежуточным повышенным (30-60 ммоль /л) SCC, который встречается примерно в 4%-5% тестов пота6, и мутациями CFTR с различными или неизвестными клиническими последствиями, диагноз не может быть подтвержден или исключен, даже если у них есть симптомы, совместимые с муковисцидозом, или положительный неонатальный скрининг-тест. Для этих случаев в диагностический алгоритм были включены физиологические анализы CFTR второй линии (разность носовых потенциалов (NPD) и измерения кишечного тока (ICM)). Эти тесты недоступны в большинстве центров и не возможны во всех возрастах, особенно у младенцев5 лет.
Ректальные органоиды представляют собой 3D-структуры, выращенные из lgr5(+) взрослых кишечных стволовых клеток из кишечных крипт, полученных путем ректальной биопсии7. Органоиды все чаще используются в биомедицинских исследованиях, таких как тестирование модуляторного лечения приCF 8. Жизнеспособная биопсия может быть получена либо путем отсасывания, либо путем щипцовой биопсии, процедуры, которая вызывает только минимальный дискомфорт и безопасна даже у младенцев, с низкой частотой осложнений9. Крипты, выделенные из ректальных биопсий, обогащаются стволовыми клетками, и при определенных условиях культивирования они самоорганизуются в ректальные органоиды. Морфология этих органоидов определяется экспрессией и функцией CFTR, расположенного на апикальной мембране эпителиальных клеток. Функциональный CFTR позволяет хлориду и воде проникать в органоидный просвет, тем самым вызывая отек органоидов, не относящихся к CF. Органоиды cf не набухают и не имеют видимого просвета10,11.
Анализ морфологии ректальных органоидов (ROMA) позволяет различать органоиды CF и без CF на основе этих различий в морфологии органоидов. Органоиды, не относящиеся к МУКовисцидозу, более круглые и имеют видимый просвет, в то время как для органоидов муковисцидоза верно обратное. Для этого анализа органоиды, специфичные для пациента, покрываются в 32 лунках 96-луночной пластины. После 1 дня роста органоиды окрашиваются кальцеином зеленого цвета и визуализируются в конфокальный микроскоп. Органоиды без CF показывают более круглую форму и менее флуоресцентную центральную часть, так как просвет содержит жидкость, а пятна кальцеина только клетки. Эти различия в морфологии количественно оцениваются с использованием двух индексов ROMA: индекс циркулярности (CI) количественно определяет округлость органоидов, в то время как коэффициент интенсивности (IR) является мерой наличия или отсутствия центрального просвета. В этом отчете мы подробно описываем протокол для получения этих дискриминирующих индексов, чтобы обеспечить репликацию метода.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы предоставляем подробный протокол анализа морфологии ректальных органоидов (ROMA). Два индекса, рассчитанные с помощью ROMA, IR и CI, отличали органоиды от субъектов с муковисцидозом от тех, у кого не было МУКовисцидоза, с идеальной точностью. Таким образом, ROMA может функционировать как новы…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим пациентов и родителей, которые участвовали в этом исследовании. Мы благодарим Abida Bibi за всю работу по культивированию органоидов. Мы благодарим Эльса Эртгертса, Каролин Брунель, Клэр Коллард, Лилиан Коллиньон, Моник Дельфосс, Аню Дельпорт, Натали Фейертс, Сесиль Ламбремон, Лют Ньювборг, Натали Петерс, Энн Раман, Пима Сансена, Хильду Стивенс, Марианну Шульте, Элса Ван Рансбека, Кристель Ван де Бранде, Грет Ван ден Эйнде, Марлин Вандеркеркен, Инге Ван Дейк, Одри Вагенер, Монику Васкевич и Бернарда Вендерикса за материально-техническую поддержку. Мы также благодарим Mucovereniging/Association Muco, и в частности Стефана Йориса и д-ра Яна Ванлеуве, за их поддержку и финансирование. Мы благодарим всех сотрудников Бельгийского органоидного проекта: Хедвиг Боболи (CHR Citadelle, Льеж, Бельгия), Линду Буланже (Университетские больницы Лёвена, Бельгия), Жоржа Казимира (HUDERF, Брюссель, Бельгия), Бенедикта Де Мейера (Университетская клиника Гента, Бельгия), Эльке Де Вахтер (Университетская клиника Брюсселя, Бельгия), Дэнни Де Лооза (Университетская клиника Гента, Бельгия), Изабель Этьен (CHU Erasme, Брюссель, Бельгия), Лоуренса Ханссенса (HUDERF, Брюссель), Кристиан Кнуп (CHU Erasme, Брюссель, Бельгия), Моник Лекен (Университетская клиника Антверпена, Бельгия), Вики Нове (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Дирк Штаессен (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Стефани Ван Бирвлиет (Университетская клиника Гента, Бельгия), Ева Ван Брекель (Университетская клиника Гента, Бельгия), Ким Ван Хуренбек (Университетская клиника Антверпена, Бельгия), Эф Вандерхельст (Университетская клиника Брюсселя, Бельгия), Стейн Верхульст (Университетская клиника Антверпена, Бельгия), Стефани Винкен (Университетская клиника Брюсселя, Бельгия).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
- Riordan, J. R., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterization of complementary DNA. Science. 245 (4922), 1066-1073 (1989).
- Castellani, C., et al. ECFS best practice guidelines: the 2018 revision. Journal of Cystic Fibrosis. 17 (2), 153-178 (2018).
- . CFTR2 Available from: https://www.cftr2.org/ (2022)
- Farrell, P. M., et al. Diagnosis of cystic fibrosis: Consensus guidelines from the cystic fibrosis foundation. The Journal of Pediatrics. 181, 4-15 (2017).
- Vermeulen, F., Lebecque, P., De Boeck, K., Leal, T. Biological variability of the sweat chloride in diagnostic sweat tests: A retrospective analysis. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 16 (1), 30-35 (2017).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Forskolin-induced swelling in intestinal organoids: An in vitro assay for assessing drug response in cystic fibrosis patients. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55159 (2017).
- Friedmacher, F., Puri, P. Rectal suction biopsy for the diagnosis of Hirschsprung’s disease: a systematic review of diagnostic accuracy and complications. Pediatric Surgery International. 31 (9), 821-830 (2015).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Dekkers, J. F., et al. Characterizing responses to CFTR-modulating drugs using rectal organoids derived from subjects with cystic fibrosis. Science Translational Medicine. 8 (344), (2016).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Cuyx, S., et al. Rectal organoid morphology analysis (ROMA) as a promising diagnostic tool in cystic fibrosis. Thorax. 76 (11), 1146-1149 (2021).
- Wilschanski, M., et al. Mutations in the cystic fibrosis transmembrane regulator gene and in vivo transepithelial potentials. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (7), 787-794 (2006).
- Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).
- Ramalho, A. S., et al. Correction of CFTR function in intestinal organoids to guide treatment of Cystic Fibrosis. European Respiratory Journal. 57, 1902426 (2020).
