Análisis de morfología organoide rectal (ROMA): un ensayo de diagnóstico en fibrosis quística
Summary
Este protocolo describe el análisis de morfología organoide rectal (ROMA), un nuevo ensayo diagnóstico para la fibrosis quística (FQ). Las características morfológicas, a saber, la redondez (índice de circularidad, IC) y la presencia de un lumen (relación de intensidad, IR), son una medida de la función CFTR. El análisis de 189 sujetos mostró una discriminación perfecta entre FQ y no FQ.
Abstract
El diagnóstico de la fibrosis quística (FQ) no siempre es sencillo, especialmente cuando la concentración de cloruro en el sudor es intermedia y / o se pueden identificar menos de dos mutaciones CFTR causantes de la enfermedad. Los ensayos fisiológicos CFTR (diferencia de potencial nasal, medición de corriente intestinal) se han incluido en el algoritmo de diagnóstico, pero no siempre están disponibles o son factibles (p. ej., en lactantes). Los organoides rectales son estructuras 3D que crecen a partir de células madre aisladas de criptas de una biopsia rectal cuando se cultivan en condiciones específicas. Los organoides de sujetos sin FQ tienen una forma redonda y una luz llena de líquido, ya que el transporte de cloruro mediado por CFTR conduce el agua hacia el lumen. Los organoides con función CFTR defectuosa no se hinchan, conservando una forma irregular y sin luz visible. Las diferencias en la morfología entre los organoides CF y no CF se cuantifican en el ‘Rectal Organoid Morphology Analysis’ (ROMA) como un nuevo ensayo fisiológico CFTR. Para el ensayo ROMA, los organoides se colocan en placas de 96 pocillos, se tiñen con calceína y se obtienen imágenes en un microscopio confocal. Las diferencias morfológicas se cuantifican utilizando dos índices: el índice de circularidad (IC) cuantifica la redondez de los organoides, y la relación de intensidad (IR) es una medida de la presencia de un lumen central. Los organoides sin FQ tienen un IC alto y un IR bajo en comparación con los organoides de FQ. Los índices ROMA discriminaron perfectamente a 167 sujetos con FQ de 22 sujetos sin FQ, lo que hace de ROMA un ensayo fisiológico CFTR atractivo para ayudar en el diagnóstico de FQ. Las biopsias rectales se pueden realizar rutinariamente a todas las edades en la mayoría de los hospitales y el tejido se puede enviar a un laboratorio central para cultivo de organoides y ROMA. En el futuro, ROMA también podría aplicarse para probar la eficacia de los moduladores CFTR in vitro. El objetivo del presente informe es explicar plenamente los métodos utilizados para la ROMA, a fin de permitir la replicación en otros laboratorios.
Introduction
La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad autosómica recesiva causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR). La proteína CFTR es un canal de cloruro y bicarbonato, asegurando la hidratación de varios epitelios1. La FQ es una enfermedad multisistémica de alta carga, que acorta la vida, que se manifiesta principalmente como una enfermedad respiratoria, pero que también afecta al tracto gastrointestinal, el páncreas, el hígado y el tracto reproductivo2.
Las mutaciones CFTR causantes de la enfermedad conducen a una disminución en la cantidad o función de CFTR, lo que a su vez causa deshidratación del moco. Se han descrito más de 2.000 variantes en el gen CFTR 3, de las cuales sólo 466 han sido ampliamente caracterizadas4.
Se puede hacer un diagnóstico de FQ cuando la concentración de cloruro en sudor (CCE) está por encima del umbral de 60 mmol / L o cuando se identifican dos mutaciones CFTR causantes de la enfermedad (según la base de datos CFTR2) 4,5. En sujetos con SCC sólo moderadamente elevado (30-60 mmol/L), que ocurre en alrededor del 4%-5% de las pruebas de sudor6, y mutaciones CFTR de consecuencia clínica variable o desconocida, el diagnóstico no puede ser confirmado ni descartado, incluso cuando tienen síntomas compatibles con FQ o una prueba de cribado neonatal positiva. Para estos casos, se han incluido en el algoritmo de diagnóstico ensayos fisiológicos de segunda línea CFTR (diferencia de potencial nasal [NPD] y mediciones de corriente intestinal [MCI]). Estas pruebas no están fácilmente disponibles en la mayoría de los centros ni son factibles en todas las edades, especialmente en bebés5.
Los organoides rectales son estructuras 3D cultivadas a partir de células madre intestinales adultas Lgr5(+) de criptas intestinales obtenidas mediante biopsia rectal7. Los organoides se utilizan cada vez más en la investigación biomédica, como el tratamiento con moduladores de prueba en CF8. Una biopsia viable puede obtenerse por succión o biopsia con fórceps, un procedimiento que causa solo molestias mínimas y es seguro incluso en bebés, con bajas tasas de complicaciones9. Las criptas aisladas de las biopsias rectales están enriquecidas en células madre y, en condiciones de cultivo específicas, se autoorganizan en organoides rectales. La morfología de estos organoides está determinada por la expresión y función de CFTR, situado en la membrana apical de las células epiteliales. El CFTR funcional permite que el cloruro y el agua entren en la luz del organoide, induciendo así la hinchazón de los organoides no CF. Los organoides de FQ no se hinchan y no tienen luz visible10,11.
El análisis morfológico de organoides rectales (ROMA) permite la discriminación entre organoides CF y no CF en función de estas diferencias en la morfología de los organoides. Los organoides sin FQ son más redondos y tienen una luz visible, mientras que lo contrario es cierto para los organoides de FQ. Para este ensayo, los organoides específicos del paciente se colocan en 32 pocillos de una placa de 96 pocillos. Después de 1 día de crecimiento, los organoides se tiñen con verde calceína y se obtienen imágenes en un microscopio confocal. Los organoides no CF muestran una forma más circular y una parte central menos fluorescente, ya que la luz contiene líquido y la calceína tiñe solo las células. Estas diferencias en la morfología se cuantifican utilizando dos índices ROMA: el índice de circularidad (IC) cuantifica la redondez de los organoides, mientras que la relación de intensidad (IR) es una medida de la presencia o ausencia de un lumen central. En este informe, describimos en detalle el protocolo para obtener estos índices discriminativos, para permitir la replicación de la técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Proporcionamos un protocolo detallado para el análisis morfológico de organoides rectales (ROMA). Los dos índices calculados con ROMA, IR e IC, distinguieron organoides de sujetos con FQ de aquellos sin FQ con perfecta precisión. ROMA podría funcionar como un nuevo ensayo fisiológico CFTR complementario al SCC y otras pruebas actualmente disponibles13,14,15.
El protocolo depende del uso de organ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los pacientes y padres que participaron en este estudio. Agradecemos a Abida Bibi por todo el trabajo de cultivo con los organoides. Agradecemos a Els Aertgeerts, Karolien Bruneel, Claire Collard, Liliane Collignon, Monique Delfosse, Anja Delporte, Nathalie Feyaerts, Cécile Lambremont, Lut Nieuwborg, Nathalie Peeters, Ann Raman, Pim Sansen, Hilde Stevens, Marianne Schulte, Els Van Ransbeeck, Christel Van de Brande, Greet Van den Eynde, Marleen Vanderkerken, Inge Van Dijck, Audrey Wagener, Monika Waskiewicz y Bernard Wenderickx por su apoyo logístico. También agradecemos a Mucovereniging/Association Muco, y específicamente a Stefan Joris y al Dr. Jan Vanleeuwe, por su apoyo y financiación. Agradecemos a todos los colaboradores del Proyecto Organoide Belga: Hedwige Boboli (CHR Citadelle, Lieja, Bélgica), Linda Boulanger (Hospitales Universitarios de Lovaina, Bélgica), Georges Casimir (HUDERF, Bruselas, Bélgica), Benedicte De Meyere (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Elke De Wachter (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica), Danny De Looze (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Isabelle Etienne (CHU Erasme, Bruselas, Bélgica), Laurence Hanssens (HUDERF, Bruselas), Christiane Knoop (CHU Erasme, Bruselas, Bélgica), Monique Lequesne (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Vicky Nowé (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Dirk Staessen (GZA St. Vincentius Hospital Antwerp), Stephanie Van Biervliet (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Eva Van Braeckel (Hospital Universitario de Gante, Bélgica), Kim Van Hoorenbeeck (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Eef Vanderhelst (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica), Stijn Verhulst (Hospital Universitario de Amberes, Bélgica), Stefanie Vincken (Hospital Universitario de Bruselas, Bélgica).
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Sorenson | 17040 | |
| 15 mL conical tubes | VWR | 525-0605 | |
| 24 well plates | Corning | 3526 | |
| 96 well plates | Greiner | 655101 | |
| Brightfield microscope | Zeiss | Axiovert 40C | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| CO2 incubator | Binder | CB160 | |
| Computer | Hewlett-Packard | Z240 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher | 51025413 | |
| Material for organoid culture as detailed in previous protocol10 | |||
| Micropipettes (20, 200, and 1000 µL) | Eppendorf | 3123000039, 3123000055, 3123000063 | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Microsoft Excel 2019 MSO 64-bit | Spreadsheet software |
| NIS-Elements Advanced Research Analysis Imaging Software | Nikon | v.5.02.00 | Imaging software |
| Pipette tips (20, 200, and 1000 µL) | Greiner | 774288, 775353, 750288 | |
| Zeiss Zen Blue software | Zeiss | v2.6 | Imaging software |
Riferimenti
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