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Biologia

Forças de Medição Direta Dentro de Feixes de Microtúbulos Ativos Reconstituídos

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63819
, ,
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies,Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para reconstituir feixes de microtúbulos in vitro e quantificar diretamente as forças exercidas dentro deles usando aprisionamento óptico simultâneo e microscopia de fluorescência de reflexão interna total. Este ensaio permite a medição em nível de nanoescala das forças e deslocamentos gerados por conjuntos de proteínas dentro de redes ativas de microtúbulos.

Abstract

As redes de microtúbulos são empregadas nas células para realizar uma ampla gama de tarefas, que vão desde atuar como trilhas para o transporte de vesículas até trabalhar como matrizes especializadas durante a mitose para regular a segregação cromossômica. As proteínas que interagem com os microtúbulos incluem motores como cinesinas e dineína, que podem gerar forças ativas e movimento direcional, bem como proteínas não motoras que reticulam filamentos em redes de ordem superior ou regulam a dinâmica do filamento. Até o momento, os estudos biofísicos de proteínas associadas a microtúbulos se concentraram esmagadoramente no papel das proteínas motoras únicas necessárias para o transporte de vesículas, e progressos significativos foram feitos na elucidação das propriedades geradoras de força e regulação mecanoquímica de cinesinas e dineínas. No entanto, para processos em que os microtúbulos atuam tanto como carga quanto como trilha, como durante o deslizamento do filamento dentro do fuso mitótico, muito menos se entende sobre a regulação biofísica dos conjuntos das proteínas de reticulação envolvidas. Aqui, detalhamos nossa metodologia para sondar diretamente a geração de força e a resposta dentro de redes mínimas de microtúbulos reticulados reconstituídas a partir de microtúbulos purificados e proteínas mitóticas. Os pares de microtúbulos são reticulados por proteínas de interesse, um microtúbulo é imobilizado para uma tampa de microscópio e o segundo microtúbulo é manipulado por uma armadilha óptica. A microscopia de fluorescência de reflexão interna total simultânea permite a visualização multicanal de todos os componentes desta rede de microtúbulos à medida que os filamentos se afastam para gerar força. Também demonstramos como essas técnicas podem ser usadas para sondar forças de empurrão exercidas por conjuntos de cinesina-5 e como forças de frenagem viscosas surgem entre pares de microtúbulos deslizantes reticulados pelo MAP mitótico PRC1. Esses ensaios fornecem insights sobre os mecanismos de montagem e função do fuso e podem ser mais amplamente adaptados para estudar a mecânica da rede de microtúbulos densos em diversos contextos, como o axônio e os dendritos dos neurônios e das células epiteliais polares.

Introduction

As células empregam redes de microtúbulos para realizar uma ampla variedade de tarefas mecânicas, que vão desde o transporte de vesículas 1,2,3 até a segregação cromossômica durante a mitose 4,5,6. Muitas das proteínas que interagem com os microtúbulos, como as proteínas motoras moleculares cinesina e dineína, geram forças e são reguladas por cargas mecânicas. Para entender melhor como essas moléculas críticas funcionam, os pesquisadores empregaram métodos biofísicos de molécula única, como aprisionamento óptico e microscopia TIRF, para monitorar diretamente parâmetros críticos, como taxas de passo descarregadas, processividade e relações força-velocidade para proteínas individuais. A geometria experimental mais comumente usada tem sido anexar proteínas motoras diretamente a contas de aprisionamento cuja geometria e tamanho esféricos imitam vesículas submetidas a transporte acionado por motor. Numerosas cinesinas, incluindo cinesina-1 7,8,9, cinesina-2 10,11,12, cinesina-3 13,14,15,16 cinesina-517,18, cinesina-8 19,20, bem como dineína e complexos de dineína21,22, 23,24,25, têm sido estudados com esses métodos.

Em muitos processos celulares, no entanto, proteínas motoras e não motoras utilizam microtúbulos tanto como esteira quanto como carga26,27. Além disso, nesses cenários em que os filamentos de microtúbulos são reticulados em feixes de ordem superior, essas proteínas funcionam como conjuntos em vez de unidades únicas. Por exemplo, dentro de células somáticas em divisão, redes de filamentos densos se auto-organizam para construir o aparelho fusiforme mitótico28,29,30. A rede de microtúbulos do fuso interpolar é altamente dinâmica e é amplamente organizada com extremidades inferiores apontando para os polos do fuso e extremidades superiores sobrepostas perto do equador do fuso. Os filamentos dentro do fuso são reticulados por proteínas motoras como a cinesina-5 31,32,33, a cinesina-12 34,35,36 e a cinesina-1437,38,39, ou por proteínas não motoras como a PRC1 40,41,42,43 ou a NuMA 44,45, 46. Eles frequentemente se movem ou experimentam estresse mecânico durante processos como o fluxo em direção aos polos ou durante a coordenação da centralização cromossômica durante a metáfase ou segregação cromossômica durante a anáfase 47,48,49,50,51,52. A integridade do aparelho fusiforme em escala mícron através da mitose, portanto, depende de um equilíbrio cuidadosamente regulado de forças de empurrar e puxar geradas e sustentadas por essa rede de filamentos que interagem. No entanto, as ferramentas necessárias para investigar essa regulação mecânica e explicar como os conjuntos de proteínas funcionam em conjunto para coordenar os movimentos dos microtúbulos e produzir as forças necessárias para montar adequadamente o fuso só recentemente foram desenvolvidas, e estamos apenas começando a entender as regras biofísicas que definem as redes dinâmicas de microtúbulos.

O objetivo deste manuscrito é demonstrar as etapas necessárias para reconstituir pares de microtúbulos reticulados in vitro, imobilizar esses feixes em uma câmara de microscopia que permita a visualização simultânea por fluorescência dos microtúbulos e proteínas reticuladas e medição de força em nanoescala, e processar esses dados de forma robusta. Detalhamos as etapas necessárias para polimerizar de forma estável os microtúbulos marcados com fluorescência, preparar as tampas do microscópio para fixação, preparar contas de poliestireno para experimentos de aprisionamento óptico e montar redes de filamentos reticulados que preservam sua funcionalidade in vivo , permitindo a manipulação biofísica direta.

Protocol

1. Preparação de microtúbulos NOTA: Ao empregar proteínas de reticulação marcadas com GFP, vermelho (por exemplo, rodamina) e vermelho-distante (por exemplo, HiLyte biotinilado647, referido como biotinilado muito vermelho no resto do texto), a marcação de fluoróforo orgânico dos microtúbulos funciona bem. O crosstalk mínimo entre os três canais pode ser alcançado durante a imagem usando um filtro de fluorescência de reflexão interna total (TIRF) de banda quádrup…

Representative Results

A preparação de feixes de microtúbulos adequados para análise biofísica é considerada bem-sucedida se vários dos principais critérios forem atendidos. Primeiramente, a imagem em três cores deve revelar dois microtúbulos alinhados com concentração de proteína reticulada decorando preferencialmente a região de sobreposição (Figura 5B,C e Figura 6B). Idealmente, a distância entre a borda de sobreposição e a extre…

Discussion

As redes de microtúbulos são empregadas por uma miríade de tipos de células para realizar uma ampla gama de tarefas que são fundamentalmente de natureza mecânica. A fim de descrever como as células funcionam em estados saudáveis e de doença, é fundamental entender como essas redes em escala mícron são organizadas e reguladas pelas proteínas do tamanho de nanômetros que as constroem coletivamente. Ferramentas biofísicas, como pinças ópticas, são adequadas para sondar a mecanoquímica de proteínas-chave …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam reconhecer o apoio do R21 AG067436 (para JP e SF), T32 AG057464 (para ET) e Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (para SF).

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915–96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237
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Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).
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