Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Abstract

Mikrotubuli-Netzwerke werden in Zellen eingesetzt, um eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen, die von der Funktion als Spuren für den Vesikeltransport bis hin zur Arbeit als spezialisierte Arrays während der Mitose reichen, um die Chromosomentrennung zu regulieren. Zu den Proteinen, die mit Mikrotubuli interagieren, gehören Motoren wie Kinesine und Dynein, die aktive Kräfte und Richtungsbewegungen erzeugen können, sowie nicht-motorische Proteine, die Filamente zu Netzwerken höherer Ordnung vernetzen oder die Filamentdynamik regulieren. Bisher haben sich biophysikalische Studien von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen überwiegend auf die Rolle einzelner Motorproteine konzentriert, die für den Vesikeltransport benötigt werden, und es wurden signifikante Fortschritte bei der Aufklärung der krafterzeugenden Eigenschaften und der mechanochemischen Regulation von Kinesinen und Dyneinen erzielt. Für Prozesse, bei denen Mikrotubuli sowohl als Fracht als auch als Spur fungieren, wie z.B. beim Gleiten von Filamenten innerhalb der mitotischen Spindel, ist jedoch viel weniger über die biophysikalische Regulation von Ensembles der beteiligten Vernetzungsproteine bekannt. Hier beschreiben wir unsere Methodik zur direkten Untersuchung der Krafterzeugung und -reaktion innerhalb vernetzter Mikrotubuli-Minimalnetzwerke, die aus gereinigten Mikrotubuli und mitotischen Proteinen rekonstituiert wurden. Mikrotubulipaare werden durch interessante Proteine vernetzt, ein Mikrotubuli wird an einem mikroskopischen Deckglas immobilisiert und das zweite Mikrotubuli wird durch eine optische Falle manipuliert. Die simultane Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie ermöglicht die Mehrkanalvisualisierung aller Komponenten dieses Mikrotubuli-Netzwerks, während die Filamente auseinandergleiten, um Kraft zu erzeugen. Wir zeigen auch, wie diese Techniken verwendet werden können, um Schubkräfte zu untersuchen, die von Kinesin-5-Ensembles ausgeübt werden, und wie viskose Bremskräfte zwischen gleitenden Mikrotubulipaaren entstehen, die durch die mitotische MAP PRC1 vernetzt sind. Diese Assays liefern Einblicke in die Mechanismen des Spindelaufbaus und der Spindelfunktion und können breiter angepasst werden, um die Mechanik des dichten Mikrotubuli-Netzwerks in verschiedenen Kontexten zu untersuchen, wie z.B. das Axon und die Dendriten von Neuronen und polaren Epithelzellen.

Introduction

Zellen verwenden Mikrotubuli-Netzwerke, um eine Vielzahl von mechanischen Aufgaben auszuführen, die vom Vesikeltransport ^1,2,3 bis zur Chromosomentrennung während der Mitose ^4,5,6 reichen. Viele der Proteine, die mit Mikrotubuli interagieren, wie die molekularen Motorproteine Kinesin und Dynein, erzeugen Kräfte und werden durch mechanische Belastungen reguliert. Um besser zu verstehen, wie diese kritischen Moleküle funktionieren, haben Forscher biophysikalische Einzelmolekülmethoden wie optisches Trapping und TIRF-Mikroskopie eingesetzt, um kritische Parameter wie unbelastete Schrittraten, Prozessivität und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehungen für einzelne Proteine direkt zu überwachen. Die am häufigsten verwendete experimentelle Geometrie bestand darin, Motorproteine direkt an Fangperlen anzuheften, deren sphärische Geometrie und Größe Vesikel nachahmen, die einem motorisch angetriebenen Transport unterzogen werden. Zahlreiche Kinesine, darunter Kinesin-1 7,8,9, Kinesin-2 10,11,12, Kinesin-3 ^13,14,15,16 Kinesin-5^17,18, Kinesin-8 ^19,20, sowie Dynein und Dynein-Komplexe^{21,22, 23,24,25}, wurden mit diesen Methoden untersucht.

In vielen zellulären Prozessen verwenden jedoch motorische und nicht-motorische Proteine Mikrotubuli sowohl als Spur als auch als Fracht^26,27. Darüber hinaus funktionieren diese Proteine in diesen Szenarien, in denen Mikrotubulifilamente zu Bündeln höherer Ordnung vernetzt sind, als Ensembles und nicht als einzelne Einheiten. Zum Beispiel organisieren sich innerhalb sich teilender somatischer Zellen dichte Filamentnetzwerke selbst, um den mitotischen Spindelapparat^28,29,30 aufzubauen. Das interpolare Spindel-Mikrotubuli-Netzwerk ist hochdynamisch und weitgehend mit Minus-Enden, die zu den Spindelpolen zeigen, und Plus-Enden, die sich in der Nähe des Spindeläquators überlappen, angeordnet. Filamente innerhalb der Spindel sind durch Motorproteine wie Kinesin-5 31,32,33, Kinesin-12 34,35,36 und Kinesin-14^37,38,39 oder durch nicht-motorische Proteine wie^PRC1 40,41,42,43 oder NuMA ^44,45 vernetzt^{. 46}. Sie bewegen sich häufig oder erfahren mechanischen Stress während Prozessen wie dem polwärts gerichteten Fluss oder bei der Koordination der Chromosomenzentrierung während der Metaphase oder der Chromosomentrennung während der Anaphase 47,48,49,50,51,52. Die Integrität des Spindelapparates im Mikrometerbereich durch Mitose beruht daher auf einem sorgfältig regulierten Gleichgewicht von Druck- und Zugkräften, die von diesem Netzwerk interagierender Filamente erzeugt und aufrechterhalten werden. Die Werkzeuge, die benötigt werden, um diese mechanische Regulation zu untersuchen und zu erklären, wie Proteinensembles zusammenarbeiten, um Mikrotubulibewegungen zu koordinieren und die Kräfte zu erzeugen, die benötigt werden, um die Spindel richtig zusammenzubauen, wurden jedoch erst kürzlich entwickelt, und wir beginnen gerade erst, die biophysikalischen Regeln zu verstehen, die dynamische Mikrotubuli-Netzwerke definieren.

Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Schritte zu demonstrieren, die erforderlich sind, um vernetzte Mikrotubulipaare in vitro zu rekonstruieren, diese Bündel di einer Mikroskopiekammer zu immobilisieren, die eine gleichzeitige Fluoreszenzvisualisierung sowohl der Mikrotubuli als auch der vernetzenden Proteine und die nanoskalige Kraftmessung ermöglicht, und diese Daten robust zu verarbeiten. Wir beschreiben die Schritte, die erforderlich sind, um fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli stabil zu polymerisieren, Mikroskopdeckgläser für die Befestigung vorzubereiten, Polystyrolperlen für optische Fangexperimente vorzubereiten und vernetzte Filamentnetzwerke zusammenzubauen, die ihre In-vivo-Funktionalität bewahren und gleichzeitig eine direkte biophysikalische Manipulation ermöglichen.

Protocol

1. Vorbereitung von Mikrotubuli HINWEIS: Bei Verwendung von GFP-markierten Vernetzungsproteinen, rot (z. B. Rhodamin) und tiefrot (z. B. biotinyliertes HiLyte647, im Rest des Textes als biotinyliertes Fernrot bezeichnet) funktioniert die organische Fluorophormarkierung der Mikrotubuli gut. Minimales Übersprechen zwischen allen drei Kanälen kann während der Bildgebung durch die Verwendung eines hochwertigen Quad-Band-TIRF-Filters (Total Internal Reflection Fluorescence) erreic…

Representative Results

Die Herstellung von Mikrotubulibündeln, die für die biophysikalische Analyse geeignet sind, gilt als erfolgreich, wenn mehrere der Schlüsselkriterien erfüllt sind. Erstens sollte die Bildgebung in drei Farben zwei ausgerichtete Mikrotubuli mit einer Konzentration von vernetzendem Protein zeigen, die bevorzugt die Überlappungsregion schmücken (Abbildung 5B, C und Abbildung 6B). Idealerweise sollte der Abstand zwischen der ?…

Discussion

Mikrotubuli-Netzwerke werden von unzähligen Zelltypen verwendet, um eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen, die grundlegend mechanischer Natur sind. Um zu beschreiben, wie Zellen sowohl im Gesundheits- als auch im Krankheitszustand funktionieren, ist es wichtig zu verstehen, wie diese Netzwerke im Mikrometerbereich von den nanometergroßen Proteinen, die sie gemeinsam aufbauen, organisiert und reguliert werden. Biophysikalische Werkzeuge wie optische Pinzetten eignen sich gut, um die Mechanochemie von Schlüsselprotein…

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm	IPG Photonics	YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications	Chroma	TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate	Invitrogen	#MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade	Fisher Scientific	18-608-395
Alpha casein from bovine milk	Sigma	1002484390
ATP	Fisher Scientific	BP413-25
Benzonase	Novagen	70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells	Millipore Sigma	71-400-3
Catalase	MP Biomedicals LLC	190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective	Nikon	N/A
Chloramphenicol	ACROS Organics	227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips	Fisher Scientific	C14784
Delicate Task Wipers	Kimberly-Clark	34120
Dextrose Anhydrous	Fisher Scientific	BP3501
D-Sucrose	Fisher Scientific	BP220-1
DTT	Fisher Scientific	BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath	LAUDA-Brinkmann	27709
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
EGTA	Millipore Corporation	32462-25GM
FIJI / Image J	https://fiji.sc/	N/A
Frosted Microscope Slides	Corning	12-553-10	75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase	MP Biomedicals LLC	195196	Type VII, without added oxygen
GMPCPP	Jena Biosciences	JBS-NU-405S	Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass	Thermo Scientific	3405
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
Imidazole	Fisher Scientific	03196-500
IPTG	Fisher Scientific	BP1755-10
Laboratory dessicator	Bel-Art	999320237	190mm plate size
Kanamycin Sulfate	Fischer Scientific	BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His	Gilbert Lab, RPI	N/A	doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe	Kimberley Clark	Z188956	lint-free tissue
Immersion Oil, Type B	Cargille	16484
Lens Tissue	ThorLabs	MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm)	Nikon	N/A
Lysozyme	MP Biomedicals LLC	100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate	Fisher Scientific	BP215-500
Microfuge 18	Beckman Coulter	367160
MPEG-SVA MW-5000	Laysan Bio, Inc.	NC0107576
Neutravadin	Invitrogen	PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope	Nikon	N/A	Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin	Thermo Scientific	88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC	IDT	N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG	IDT	N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm	Beckman Coulter	343755
Optima-TLX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	361544
Paclitaxel (Taxol equivalent)	Thermo Fisher Scientific	P3456
PIPES	ACROS Organics	172615000
PMSF	Millipore	7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label	Cytoskeleton, Inc.	T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor	Cytoskeleton, Inc.	TL670M	far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine	Cytoskeleton, Inc.	TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein	Cytoskeleton, Inc.	T240
Potassium Acetate	Fisher Scientific	BP364-500
Prime 95B sCMOS camera	Photometric	N/A
Quadrant Detector Sensor Head	ThorLabs	PDQ80A
Quikchange Lightning Kit	Agilent Technologies	210518
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific	S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous	Fisher Scientific	BP332-500
Square Cover Glasses	Corning	12-553-450	18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres	Polysciences Inc.	24162-1
Superose-6 Column	GE Healthcare	29-0915–96
TCEP	Thermo Scientific	77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor	Beckman Coulter	343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator)	Vevor	JPS-08A(DD)	304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution	Vector Laboratories	SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D	S.C. Johnson	SJN695237