यहां, हम विट्रो में सूक्ष्मनलिका बंडलों के पुनर्गठन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और एक साथ ऑप्टिकल ट्रैपिंग और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उनके भीतर लगाए गए बलों को सीधे निर्धारित करते हैं। यह परख सक्रिय सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के भीतर प्रोटीन पहनावा द्वारा उत्पन्न बलों और विस्थापन के नैनोस्केल-स्तरीय माप की अनुमति देती है।
माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क को कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को पूरा करने के लिए कोशिकाओं में नियोजित किया जाता है, जिसमें पुटिका परिवहन के लिए ट्रैक के रूप में कार्य करने से लेकर क्रोमोसोम अलगाव को विनियमित करने के लिए माइटोसिस के दौरान विशेष सरणियों के रूप में काम करना शामिल है। सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करने वाले प्रोटीन में काइन्सिन और डायनेन जैसे मोटर शामिल होते हैं, जो सक्रिय बल और दिशात्मक गति उत्पन्न कर सकते हैं, साथ ही गैर-मोटर प्रोटीन जो फिलामेंट्स को उच्च क्रम के नेटवर्क में क्रॉसलिंक करते हैं या फिलामेंट गतिशीलता को विनियमित करते हैं। आज तक, सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन के बायोफिज़िकल अध्ययनों ने पुटिका परिवहन के लिए आवश्यक एकल मोटर प्रोटीन की भूमिका पर अत्यधिक ध्यान केंद्रित किया है, और बल पैदा करने वाले गुणों और काइन्सिन और डायनिन के मेकेनोकेमिकल विनियमन को स्पष्ट करने में महत्वपूर्ण प्रगति हुई है। हालांकि, उन प्रक्रियाओं के लिए जिनमें सूक्ष्मनलिकाएं कार्गो और ट्रैक दोनों के रूप में कार्य करती हैं, जैसे कि माइटोटिक स्पिंडल के भीतर फिलामेंट स्लाइडिंग के दौरान, इसमें शामिल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन के पहनावा के बायोफिज़िकल विनियमन के बारे में बहुत कम समझा जाता है। यहां, हम शुद्ध सूक्ष्मनलिकाएं और माइटोटिक प्रोटीन से पुनर्गठित क्रॉसलिंक्ड माइक्रोट्यूबुल्स न्यूनतम नेटवर्क के भीतर बल उत्पादन और प्रतिक्रिया की सीधे जांच के लिए हमारी पद्धति का विस्तार करते हैं। माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े रुचि के प्रोटीन द्वारा क्रॉसलिंक किए जाते हैं, एक सूक्ष्मनलिका को माइक्रोस्कोप कवरस्लिप में स्थिर किया जाता है, और दूसरे सूक्ष्मनलिका को ऑप्टिकल ट्रैप द्वारा हेरफेर किया जाता है। एक साथ कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इस सूक्ष्मनलिका नेटवर्क के सभी घटकों के मल्टीचैनल विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है क्योंकि फिलामेंट्स बल उत्पन्न करने के लिए अलग हो जाते हैं। हम यह भी प्रदर्शित करते हैं कि इन तकनीकों का उपयोग काइन्सिन -5 एन्सेंबल द्वारा लगाए गए धक्का बलों की जांच करने के लिए कैसे किया जा सकता है और माइटोटिक एमएपी पीआरसी 1 द्वारा क्रॉसलिंक किए गए स्लाइडिंग माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े के बीच चिपचिपा ब्रेकिंग बल कैसे उत्पन्न होते हैं। ये परख स्पिंडल असेंबली और फ़ंक्शन के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं और विभिन्न संदर्भों में घने सूक्ष्मनलिका नेटवर्क यांत्रिकी का अध्ययन करने के लिए अधिक व्यापक रूप से अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे कि न्यूरॉन्स और ध्रुवीय उपकला कोशिकाओं के अक्षतंतु और डेंड्राइट।
कोशिकाएं सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को यांत्रिक कार्यों की एक विस्तृत विविधता को करने के लिए नियोजित करती हैं, जिसमें माइटोसिस 4,5,6 के दौरान पुटिका परिवहन 1,2,3 से लेकर गुणसूत्र अलगाव तक शामिल हैं। कई प्रोटीन जो सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करते हैं, जैसे आणविक मोटर प्रोटीन काइन्सिन और डायनिन, बल उत्पन्न करते हैं और यांत्रिक भार द्वारा विनियमित होते हैं। ये महत्वपूर्ण अणु कैसे कार्य करते हैं, यह बेहतर ढंग से समझने के लिए, शोधकर्ताओं ने एकल-अणु बायोफिज़िकल विधियों, जैसे ऑप्टिकल ट्रैपिंग और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को नियोजित किया है, ताकि व्यक्तिगत प्रोटीन के लिए अनलोडेड स्टेपिंग दर, प्रक्रियाशीलता और बल-वेग संबंधों जैसे महत्वपूर्ण मापदंडों की सीधे निगरानी की जा सके। सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली प्रयोगात्मक ज्यामिति मोटर प्रोटीन को सीधे मोतियों को फंसाने के लिए संलग्न करने के लिए किया गया है जिनकी गोलाकार ज्यामिति और आकार मोटर-संचालित परिवहन से गुजरने वाले पुटिकाओं की नकल करते हैं। काइन्सिन -1 7,8,9, काइन्सिन -2 10,11,12, काइन्सिन -313,14,15,16 किनेसिन –5 17,18, किन्सिन –8 19,20, साथ ही डायनेन और डायनेइन कॉम्प्लेक्स21,22, इन विधियों के साथ 23,24,25 का अध्ययन किया गया है।
कई सेलुलर प्रक्रियाओं में, हालांकि, मोटर और गैर-मोटर प्रोटीन ट्रैक और कार्गो26,27 दोनों के रूप में सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, इन परिदृश्यों में जहां सूक्ष्मनलिका तंतुओं को उच्च-क्रम के बंडलों में क्रॉसलिंक किया जाता है, ये प्रोटीन एकल इकाइयों के बजाय पहनावा के रूप में कार्य करते हैं। उदाहरण के लिए, दैहिक कोशिकाओं को विभाजित करने के भीतर, घने फिलामेंट नेटवर्क माइटोटिक स्पिंडल उपकरण 28,29,30 के निर्माण के लिए स्वयं-व्यवस्थित होते हैं। इंटरपोलर स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क अत्यधिक गतिशील है और काफी हद तक स्पिंडल ध्रुवों की ओर इशारा करने वाले माइनस-एंड्स के साथ व्यवस्थित होता है और स्पिंडल भूमध्य रेखा के पास ओवरलैपिंग प्लस-एंड्स ओवरलैपिंग होता है। स्पिंडल के भीतर फिलामेंट्स मोटर प्रोटीन जैसे कि किनेसिन -5 31,32,33, किनेसिन -1234,35,36, और काइन्सिन -14 37,38,39, या गैर-मोटर प्रोटीन जैसे पीआरसी 1 40,41,42,43 या एनयूएमए 44,45 द्वारा क्रॉसलिंक किए जाते हैं। 46. वे अक्सर पोलवर्ड फ्लक्स जैसी प्रक्रियाओं के दौरान यांत्रिक तनाव को स्थानांतरित या अनुभव करते हैं या एनाफ़ेज़ 47,48,49,50,51,52 के दौरान मेटाफ़ेज़ या क्रोमोसोम अलगाव के दौरान क्रोमोसोम सेंटरिंग का समन्वय करते हैं। माइटोसिस के माध्यम से माइक्रोन-स्केल स्पिंडल तंत्र की अखंडता, इसलिए, बातचीत फिलामेंट्स के इस नेटवर्क द्वारा उत्पन्न और बनाए रखने वाले बलों को धक्का देने और खींचने के सावधानीपूर्वक विनियमित संतुलन पर निर्भर करती है। हालांकि, इस यांत्रिक विनियमन की जांच करने और यह समझाने के लिए आवश्यक उपकरण कि माइक्रोट्यूबुल्स गति को समन्वयित करने और स्पिंडल को ठीक से इकट्ठा करने के लिए आवश्यक बलों का उत्पादन करने के लिए प्रोटीन पहनावा कैसे काम करता है, हाल ही में विकसित किया गया है, और हम अभी बायोफिज़िकल नियमों को समझना शुरू कर रहे हैं जो गतिशील सूक्ष्मनलिका नेटवर्क को परिभाषित करते हैं।
इस पांडुलिपि का लक्ष्य विट्रो में क्रॉसलिंक्ड माइक्रोट्यूबुल्स जोड़े को पुनर्गठित करने के लिए आवश्यक चरणों को प्रदर्शित करना है, इन बंडलों को एक माइक्रोस्कोपी कक्ष में स्थिर करना है जो सूक्ष्मनलिकाएं और क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन और नैनोस्केल बल माप दोनों के एक साथ प्रतिदीप्ति विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है, और इन डेटा को मजबूती से संसाधित करता है। हम फ्लोरेसेंस-लेबल माइक्रोट्यूबुल्स को स्थिर रूप से पॉलीमराइज करने, अटैचमेंट के लिए माइक्रोस्कोप कवरलिप तैयार करने, ऑप्टिकल ट्रैपिंग प्रयोगों के लिए पॉलीस्टाइनिन बीड्स तैयार करने और क्रॉसलिंक्ड फिलामेंट नेटवर्क को इकट्ठा करने के लिए आवश्यक चरणों का विस्तार करते हैं जो प्रत्यक्ष बायोफिज़िकल हेरफेर की अनुमति देते हुए उनकी विवो कार्यक्षमता को संरक्षित करते हैं।
माइक्रोट्यूबुल्स नेटवर्क को असंख्य सेल प्रकारों द्वारा कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को पूरा करने के लिए नियोजित किया जाता है जो प्रकृति में मौलिक रूप से यांत्रिक हैं। यह वर्णन करने के लिए कि स्वस्?…
The authors have nothing to disclose.
लेखक आर 21 एजी 067436 (जेपी और एसएफ के लिए), टी 32 एजी 057464 (ईटी के लिए), और रेनसेलर पॉलिटेक्निक इंस्टीट्यूट स्कूल ऑफ साइंस स्टार्टअप फंड्स (एसएफ के लिए) से समर्थन स्वीकार करना चाहते हैं।
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915–96 | |
TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |