JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Непосредственное измерение сил в восстановленных активных пучках микротрубочек

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63819
, ,
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies,Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

Здесь мы представляем протокол восстановления пучков микротрубочек in vitro и непосредственной количественной оценки сил, оказываемых внутри них, с помощью одновременного оптического улавливания и флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения. Этот анализ позволяет измерять на наноуровневом уровне силы и смещения, генерируемые белковыми ансамблями в активных сетях микротрубочек.

Abstract

Сети микротрубочек используются в клетках для выполнения широкого круга задач, начиная от действия в качестве треков для переноса пузырьков до работы в качестве специализированных массивов во время митоза для регулирования сегрегации хромосом. Белки, которые взаимодействуют с микротрубочками, включают такие двигатели, как кинезины и динеин, которые могут генерировать активные силы и направленное движение, а также немоторные белки, которые сшивают нити в сети более высокого порядка или регулируют динамику нитей. На сегодняшний день биофизические исследования белков, связанных с микротрубочками, в подавляющем большинстве случаев сосредоточены на роли одиночных моторных белков, необходимых для переноса пузырьков, и был достигнут значительный прогресс в выяснении силообразующих свойств и механохимической регуляции кинезинов и динеинов. Однако для процессов, в которых микротрубочки действуют как груз, так и как путь, например, во время скольжения нити внутри митотического веретена, гораздо меньше понимается о биофизической регуляции ансамблей вовлеченных сшивающих белков. Здесь мы подробно описываем нашу методологию непосредственного зондирования генерации силы и реакции в сшитых минимальных сетях микротрубочек, восстановленных из очищенных микротрубочек и митотических белков. Пары микротрубочек сшиваются интересующими белками, одна микротрубочка иммобилизуется в крышку микроскопа, а вторая микротрубочка управляется оптической ловушкой. Одновременная флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения позволяет осуществлять многоканальную визуализацию всех компонентов этой сети микротрубочек, поскольку нити раздвигаются для создания силы. Мы также демонстрируем, как эти методы могут быть использованы для зондирования толкающих сил, оказываемых ансамблями кинезин-5, и как вязкие тормозные силы возникают между скользящими парами микротрубочек, сшитыми митотическим MAP PRC1. Эти анализы дают представление о механизмах сборки и функционирования веретена и могут быть более широко адаптированы для изучения плотной сетевой механики микротрубочек в различных контекстах, таких как аксон и дендриты нейронов и полярных эпителиальных клеток.

Introduction

Клетки используют сети микротрубочек для выполнения широкого спектра механических задач, начиная от переносапузырьков 1,2,3 до сегрегации хромосом во время митоза 4,5,6. Многие из белков, которые взаимодействуют с микротрубочками, такие как молекулярные моторные белки кинезин и динеин, генерируют силы и регулируются механическими нагрузками. Чтобы лучше понять, как функционируют эти критические молекулы, исследователи использовали одномолекулярные биофизические методы, такие как оптическое улавливание и микроскопия TIRF, для непосредственного мониторинга критических параметров, таких как скорость разгруженного шага, качучесть и отношения силы-скорости для отдельных белков. Наиболее часто используемой экспериментальной геометрией было прикрепление моторных белков непосредственно к улавливающим шарикам, сферическая геометрия и размер которых имитируют везикулы, подвергающиеся моторному транспорту. Многочисленные кинезины, в том числе кинезин-1 7,8,9, кинезин-2 10,11,12, кинезин-3 13,14,15,16 кинезин-5 17,18, кинезин-819,20, а также динеиновые и динеиновые комплексы21,22, 23,24,25 были изучены с помощью этих методов.

Однако во многих клеточных процессах моторные и немоторные белки используют микротрубочки как в качестве трека, так и в качестве груза26,27. Более того, в этих сценариях, где нити микротрубочек сшиваются в пучки более высокого порядка, эти белки функционируют как ансамбли, а не отдельные единицы. Например, внутри делящихся соматических клеток плотные нитевидные сети самоорганизуются для построения митотического веретенообразного аппарата 28,29,30. Межполярная сеть микротрубочек шпинделя очень динамична и в значительной степени расположена с минусовыми концами, указывающими на полюса шпинделя, и плюс-концами, перекрывающимися вблизи экватора шпинделя. Нити внутри веретена сшиты моторными белками, такими как кинезин-5 31,32,33, кинезин-12 34,35,36 и кинезин-14 37,38,39, или немоторными белками, такими как PRC1 40,41,42,43 или NuMA 44,45, 46. Они часто перемещаются или испытывают механическое напряжение во время таких процессов, как поток в направлении полюса или при координации центрирования хромосом во время метафазы или сегрегации хромосом во время анафазы 47,48,49,50,51,52. Таким образом, целостность аппарата веретена микронного масштаба посредством митоза зависит от тщательно регулируемого баланса сил толкания и притяжения, создаваемых и поддерживаемых этой сетью взаимодействующих нитей. Тем не менее, инструменты, необходимые для исследования этой механической регуляции и объяснения того, как белковые ансамбли работают согласованно, чтобы координировать движения микротрубочек и производить силы, необходимые для правильной сборки веретена, были разработаны только недавно, и мы только начинаем понимать биофизические правила, которые определяют динамические сети микротрубочек.

Цель этой рукописи состоит в том, чтобы продемонстрировать шаги, необходимые для воссоздания сшитых пар микротрубочек in vitro, иммобилизации этих пучков в камере микроскопии, которая позволяет одновременно флуоресцентную визуализацию как микротрубочек, так и сшивающих белков и наноразмерного измерения силы, и надежно обрабатывать эти данные. Мы подробно описываем шаги, необходимые для стабильной полимеризации флуоресцентных меченых микротрубочек, подготовки крышек микроскопа к прикреплению, подготовки полистирольных шариков для экспериментов по оптическому улавливанию и сборки сшитых нитевидных сетей, которые сохраняют свою функциональность in vivo , позволяя проводить прямые биофизические манипуляции.

Protocol

1. Подготовка микротрубочек ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании меченых GFP сшивающих белков красный (например, родамин) и дальний красный (например, биотинилированный HiLyte647, называемый биотинилированным дальним красным цветом в остальной части текста) органическая флу…

Representative Results

Подготовка пучков микротрубочек, пригодных для биофизического анализа, считается успешной при соблюдении нескольких ключевых критериев. Во-первых, визуализация в трех цветах должна выявить две выровненные микротрубочки с концентрацией сшивающего белка, предпочтительно украшающего …

Discussion

Сети микротрубочек используются множеством типов клеток для выполнения широкого круга задач, которые по своей природе являются механическими. Чтобы описать, как клетки функционируют как в здоровом, так и в болезненном состоянии, важно понять, как эти микронные сети организованы и регу…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы отметить поддержку со стороны R21 AG067436 (JP и SF), T32 AG057464 (et) и Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (sF).

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915–96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biologia. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biologia. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. . SMART – Servier Medical ART Available from: https://smart.servier.com/ (2022)
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Microtubule BundlesCytoskeletal NetworksForce MeasurementOptical TrapTIRF MicroscopySingle-molecule ExperimentsProtein ConcentrationProtein DensityMitosisNeural DevelopmentMuscle ContractionCell MigrationStreptavidinNeutrAvidinCaseinBiotinylated MicrotubulesRhodamine MicrotubulesRigor Kinesin-coated BeadsReaction Buffer
check_url/it/63819?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image