Här presenterar vi ett protokoll för rekonstituering av mikrotubulibuntar in vitro och direkt kvantifiera de krafter som utövas inom dem med hjälp av samtidig optisk fångst och total intern reflektionsfluorescensmikroskopi. Denna analys möjliggör mätning på nanonivå av de krafter och förskjutningar som genereras av proteinensembler inom aktiva mikrotubulinätverk.
Mikrotubuli nätverk används i celler för att utföra ett brett spektrum av uppgifter, allt från att fungera som spår för vesikeltransport till att arbeta som specialiserade arrays under mitos för att reglera kromosomsegregering. Proteiner som interagerar med mikrotubuli inkluderar motorer som kinesiner och dynein, som kan generera aktiva krafter och riktningsrörelse, liksom icke-motoriska proteiner som tvärbinder filament till högre ordningsnätverk eller reglerar filamentdynamik. Hittills har biofysiska studier av mikrotubuliassocierade proteiner överväldigande fokuserat på rollen som enmotoriga proteiner som behövs för vesikeltransport, och betydande framsteg har gjorts för att belysa de kraftgenererande egenskaperna och mekanokemisk reglering av kinesiner och dyneiner. För processer där mikrotubuli fungerar både som last och spår, såsom under filamentglidning i den mitotiska spindeln, förstås mycket mindre om den biofysiska regleringen av ensembler av de tvärbindande proteinerna som är inblandade. Här beskriver vi vår metodik för direkt sonderande kraftgenerering och respons inom tvärbundna mikrotubuli minimala nätverk rekonstituerade från renade mikrotubuli och mitotiska proteiner. Mikrotubulipar är tvärbundna av proteiner av intresse, en mikrotubuli immobiliseras till ett mikroskopskydd och den andra mikrotubulen manipuleras av en optisk fälla. Samtidig total intern reflektionsfluorescensmikroskopi möjliggör flerkanalig visualisering av alla komponenter i detta mikrotubulinätverk när filamenten glider isär för att generera kraft. Vi demonstrerar också hur dessa tekniker kan användas för att undersöka tryckkrafter som utövas av kinesin-5-ensembler och hur viskösa bromskrafter uppstår mellan glidande mikrotubulipar tvärbundna av den mitotiska MAP PRC1. Dessa analyser ger insikter i mekanismerna för spindelmontering och funktion och kan anpassas bredare för att studera tät mikrotubulinätverksmekanik i olika sammanhang, såsom axon och dendriter av neuroner och polära epitelceller.
Celler använder mikrotubulinätverk för att utföra en mängd olika mekaniska uppgifter, allt från vesikeltransport 1,2,3 till kromosomsegregering under mitos 4,5,6. Många av de proteiner som interagerar med mikrotubuli, såsom de molekylära motorproteinerna kinesin och dynein, genererar krafter och regleras av mekaniska belastningar. För att bättre förstå hur dessa kritiska molekyler fungerar har forskare använt enmolekylära biofysiska metoder, såsom optisk fångst och TIRF-mikroskopi, för att direkt övervaka kritiska parametrar som lossade steghastigheter, processivitet och krafthastighetsrelationer för enskilda proteiner. Den vanligaste experimentella geometrin har varit att fästa motorproteiner direkt på fångpärlor vars sfäriska geometri och storlek efterliknar vesiklar som genomgår motordriven transport. Många kinesiner, inklusive kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-8 19,20, samt dynein- och dyneinkomplex21,22, 23,24,25, har studerats med dessa metoder.
I många cellulära processer använder dock motoriska och icke-motoriska proteiner mikrotubuli både som spår och last26,27. Dessutom, i dessa scenarier där mikrotubulifilament är tvärbundna till högre ordningens buntar, fungerar dessa proteiner som ensembler snarare än enskilda enheter. Till exempel, inom delande somatiska celler, organiserar täta filamentnätverk sig själv för att bygga den mitotiska spindelapparaten28,29,30. Det interpolära spindelmikrotubulinätverket är mycket dynamiskt och är till stor del anordnat med minusändar som pekar mot spindelpolerna och plusändarna som överlappar varandra nära spindelekvatorn. Filament i spindeln är tvärbundna av motorproteiner såsom kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 och kinesin-1437,38,39, eller av icke-motoriska proteiner såsom PRC1 40,41,42,43 eller NuMA 44,45, 46. De rör sig ofta eller upplever mekanisk stress under processer som polewardflöde eller när de samordnar kromosomcentrering under metafas- eller kromosomsegregering under anafas 47,48,49,50,51,52. Integriteten hos spindelapparaten i mikronskala genom mitos är därför beroende av en noggrant reglerad balans mellan tryck- och dragkrafter som genereras och upprätthålls av detta nätverk av interagerande filament. Men de verktyg som behövs för att undersöka denna mekaniska reglering och förklara hur proteinensembler arbetar tillsammans för att samordna mikrotubulirörelser och producera de krafter som behövs för att korrekt montera spindeln har först nyligen utvecklats, och vi har precis börjat förstå de biofysiska reglerna som definierar dynamiska mikrotubulinätverk.
Målet med detta manuskript är att demonstrera de steg som krävs för att rekonstituera tvärbundna mikrotubulipar in vitro, immobilisera dessa buntar i en mikroskopikammare som möjliggör samtidig fluorescensvisualisering av både mikrotubuli och tvärbindande proteiner och nanoskala kraftmätning och bearbeta dessa data robust. Vi beskriver de steg som behövs för att stabilt polymerisera fluorescensmärkta mikrotubuli, förbereda mikroskopskydd för fastsättning, förbereda polystyrenpärlor för optiska fångstexperiment och montera tvärbundna filamentnätverk som bevarar deras in vivo-funktionalitet samtidigt som de möjliggör direkt biofysisk manipulation.
Mikrotubuli nätverk används av otaliga celltyper för att utföra ett brett spektrum av uppgifter som är fundamentalt mekaniska till sin natur. För att beskriva hur celler fungerar i både friska och sjukdomstillstånd är det viktigt att förstå hur dessa nätverk i mikronskala organiseras och regleras av de nanometerstora proteiner som tillsammans bygger dem. Biofysiska verktyg som optisk pincett är väl lämpade för att undersöka mekanokemin hos nyckelproteiner i denna skala. Komplexa experimentella geometrier…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill erkänna stöd från R21 AG067436 (till JP och SF), T32 AG057464 (till ET) och Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (till SF).
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm | IPG Photonics | YLR-10-1064-LP | |
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications | Chroma | TRF89901v2 | |
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate | Invitrogen | #MA1-21315-BTIN | |
Acetone, HPLC grade | Fisher Scientific | 18-608-395 | |
Alpha casein from bovine milk | Sigma | 1002484390 | |
ATP | Fisher Scientific | BP413-25 | |
Benzonase | Novagen | 70746-3 | |
Biotin-PEG-SVA-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0479433 | |
BL21 (DE3) Rosetta Cells | Millipore Sigma | 71-400-3 | |
Catalase | MP Biomedicals LLC | 190311 | |
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective | Nikon | N/A | |
Chloramphenicol | ACROS Organics | 227920250 | |
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips | Fisher Scientific | C14784 | |
Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | 34120 | |
Dextrose Anhydrous | Fisher Scientific | BP3501 | |
D-Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
DTT | Fisher Scientific | BP172-25 | |
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath | LAUDA-Brinkmann | 27709 | |
EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
EGTA | Millipore Corporation | 32462-25GM | |
FIJI / Image J | https://fiji.sc/ | N/A | |
Frosted Microscope Slides | Corning | 12-553-10 | 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm |
Glucose Oxidase | MP Biomedicals LLC | 195196 | Type VII, without added oxygen |
GMPCPP | Jena Biosciences | JBS-NU-405S | Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C |
Gold Seal-Cover Glass | Thermo Scientific | 3405 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 | |
Imidazole | Fisher Scientific | 03196-500 | |
IPTG | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
Laboratory dessicator | Bel-Art | 999320237 | 190mm plate size |
Kanamycin Sulfate | Fischer Scientific | BP906-5 | |
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His | Gilbert Lab, RPI | N/A | doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182 |
Kimwipe | Kimberley Clark | Z188956 | lint-free tissue |
Immersion Oil, Type B | Cargille | 16484 | |
Lens Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) | Nikon | N/A | |
Lysozyme | MP Biomedicals LLC | 100834 | |
Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher Scientific | BP215-500 | |
Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
MPEG-SVA MW-5000 | Laysan Bio, Inc. | NC0107576 | |
Neutravadin | Invitrogen | PI31000 | |
Nikon Ti-E inverted microscope | Nikon | N/A | Nikon LuN4 Laser |
Ni-NTA Resin | Thermo Scientific | 88221 | |
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA GAACTTTCAAAGGC |
IDT | N/A | |
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA ACTCAGAATAGGTG |
IDT | N/A | |
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm | Beckman Coulter | 343755 | |
Optima-TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361544 | |
Paclitaxel (Taxol equivalent) | Thermo Fisher Scientific | P3456 | |
PIPES | ACROS Organics | 172615000 | |
PMSF | Millipore | 7110-5GM | |
Porcine Tubulin, biotin label | Cytoskeleton, Inc. | T333P | |
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor | Cytoskeleton, Inc. | TL670M | far red labelled |
Porcine Tubulin, Rhodamine | Cytoskeleton, Inc. | TL590M | |
Porcine Tubulin, Tubulin Protein | Cytoskeleton, Inc. | T240 | |
Potassium Acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
Prime 95B sCMOS camera | Photometric | N/A | |
Quadrant Detector Sensor Head | ThorLabs | PDQ80A | |
Quikchange Lightning Kit | Agilent Technologies | 210518 | |
Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous | Fisher Scientific | BP332-500 | |
Square Cover Glasses | Corning | 12-553-450 | 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm |
Streptavidin Microspheres | Polysciences Inc. | 24162-1 | |
Superose-6 Column | GE Healthcare | 29-0915–96 | |
TCEP | Thermo Scientific | 77720 | |
TLA-100 Fixed-Angle Rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) | Vevor | JPS-08A(DD) | 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power |
Vectabond APTES solution | Vector Laboratories | SP-1800-7 | |
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D | S.C. Johnson | SJN695237 |