JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Risultati
Discussion
Divulgazioni
Acknowledgements
Materials
Riferimenti
Traduzione automatica
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Yeniden yapılandırılmış aktif mikrotübül demetleri içindeki kuvvetleri doğrudan ölçme

Published: May 10, 2022
doi:
10.3791/63819
, ,
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies,Rensselaer Polytechnic Institute

Summary

Burada, mikrotübül demetlerini in vitro olarak yeniden yapılandırmak ve eşzamanlı optik yakalama ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak içlerinde uygulanan kuvvetleri doğrudan ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, aktif mikrotübül ağları içindeki protein toplulukları tarafından üretilen kuvvetlerin ve yer değiştirmelerin nano ölçekte ölçülmesine izin verir.

Abstract

Mikrotübül ağları, vezikül taşınması için izler olarak hareket etmekten, kromozom ayrışmasını düzenlemek için mitoz sırasında özel diziler olarak çalışmaya kadar çok çeşitli görevleri yerine getirmek için hücrelerde kullanılır. Mikrotübüllerle etkileşime giren proteinler, aktif kuvvetler ve yönlü hareket üretebilen kinezinler ve dinein gibi motorların yanı sıra filamentleri daha yüksek dereceli ağlara çapraz bağlayan veya filament dinamiklerini düzenleyen motor olmayan proteinleri içerir. Bugüne kadar, mikrotübül ile ilişkili proteinlerin biyofiziksel çalışmaları, vezikül taşınması için gerekli olan tek motorlu proteinlerin rolüne odaklanmış ve kinezinlerin ve dineinlerin kuvvet üreten özelliklerinin ve mekanokimyasal regülasyonunun aydınlatılmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, mikrotübüllerin hem kargo hem de iz olarak hareket ettiği süreçler için, örneğin mitotik iğ içinde kayan filament sırasında, ilgili çapraz bağlanan proteinlerin topluluklarının biyofiziksel düzenlemesi hakkında çok daha az şey anlaşılmaktadır. Burada, saflaştırılmış mikrotübüllerden ve mitotik proteinlerden yeniden oluşturulan çapraz bağlı mikrotübül minimal ağları içinde doğrudan problama kuvveti üretimi ve yanıtı için metodolojimizi detaylandırıyoruz. Mikrotübül çiftleri, ilgilenilen proteinlerle çapraz bağlanır, bir mikrotübül mikroskop kapağına hareketsiz hale getirilir ve ikinci mikrotübül optik bir tuzak tarafından manipüle edilir. Eşzamanlı toplam iç yansıma floresan mikroskobu, filamentler kuvvet üretmek için birbirinden ayrılırken bu mikrotübül ağının tüm bileşenlerinin çok kanallı olarak görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu tekniklerin kinesin-5 toplulukları tarafından uygulanan itme kuvvetlerini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini ve mitotik MAP PRC1 tarafından çapraz bağlanmış kayan mikrotübül çiftleri arasında viskoz frenleme kuvvetlerinin nasıl ortaya çıktığını da gösteriyoruz. Bu analizler, iğ montajı ve fonksiyon mekanizmaları hakkında fikir verir ve nöronların ve polar epitel hücrelerinin akson ve dendritleri gibi çeşitli bağlamlarda yoğun mikrotübül ağ mekaniğini incelemek için daha geniş çapta uyarlanabilir.

Introduction

Hücreler, vezikül taşınması 1,2,3’ten mitoz 4,5,6 sırasında kromozom ayrışmasına kadar çok çeşitli mekanik görevleri yerine getirmek için mikrotübül ağları kullanır. Moleküler motor proteinler kinesin ve dynein gibi mikrotübüllerle etkileşime giren proteinlerin çoğu, kuvvetler üretir ve mekanik yükler tarafından düzenlenir. Bu kritik moleküllerin nasıl çalıştığını daha iyi anlamak için araştırmacılar, boş adım atma hızları, süreçsellik ve bireysel proteinler için kuvvet-hız ilişkileri gibi kritik parametreleri doğrudan izlemek için optik tuzak ve TIRF mikroskobu gibi tek moleküllü biyofiziksel yöntemler kullandılar. En yaygın kullanılan deneysel geometri, motor proteinlerini doğrudan küresel geometrisi ve boyutu motor tahrikli taşımaya tabi tutulan vezikülleri taklit eden tuzak boncuklarına bağlamak olmuştur. Kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-3 13,14,15,16 kinesin-5 17,18, kinesin-8 19,20 dahil olmak üzere çok sayıda kinezin, ayrıca dynein ve dynein kompleksleri21,22, 23,24,25, bu yöntemlerle çalışılmıştır.

Bununla birlikte, birçok hücresel süreçte, motor ve motor olmayan proteinler mikrotübülleri hem iz hem de kargo olarak kullanır26,27. Dahası, mikrotübül filamentlerinin daha yüksek dereceli demetlere çapraz bağlandığı bu senaryolarda, bu proteinler tek birimlerden ziyade topluluklar olarak işlev görür. Örneğin, somatik hücrelerin bölünmesinde, yoğun filament ağları, mitotik iğ aparatını 28,29,30 oluşturmak için kendi kendini organize eder. Polarlar arası iş mili mikrotübül ağı oldukça dinamiktir ve büyük ölçüde iş mili direktörlerine ve iş mili ekvatorunun yakınında üst üste binen artı uçlara işaret eden eksi uçlarla düzenlenmiştir. İş mili içindeki filamentler, kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 ve kinesin-14 37,38,39 gibi motor proteinler veya PRC1 40,41,42,43 veya NuMA 44,45 gibi motor olmayan proteinler tarafından çapraz bağlanır. 46. Kutupsal akı gibi süreçler sırasında veya metafaz sırasında kromozom merkezlenmesini koordine ederken veya anafaz 47,48,49,50,51,52 sırasında kromozom ayrışmasını koordine ederken sıklıkla mekanik stres yaşarlar veya yaşarlar. Bu nedenle, mikron ölçekli iş mili aparatının mitoz yoluyla bütünlüğü, bu etkileşimli filamentler ağı tarafından üretilen ve sürdürülen itme ve çekme kuvvetlerinin dikkatlice düzenlenmiş bir dengesine dayanır. Bununla birlikte, bu mekanik düzenlemeyi araştırmak ve protein topluluklarının mikrotübül hareketlerini koordine etmek ve iş milini düzgün bir şekilde monte etmek için gereken kuvvetleri üretmek için nasıl uyum içinde çalıştığını açıklamak için gereken araçlar sadece yakın zamanda geliştirilmiştir ve dinamik mikrotübül ağlarını tanımlayan biyofiziksel kuralları anlamaya yeni başlıyoruz.

Bu makalenin amacı, çapraz bağlı mikrotübül çiftlerini in vitro olarak yeniden oluşturmak, bu demetleri hem mikrotübüllerin hem de çapraz bağlanan proteinlerin eşzamanlı floresan görselleştirmesine ve nano ölçekli kuvvet ölçümüne izin veren bir mikroskopi odasında hareketsiz hale getirmek ve bu verileri sağlam bir şekilde işlemek için gerekli adımları göstermektir. Floresan etiketli mikrotübülleri istikrarlı bir şekilde polimerize etmek, bağlantı için mikroskop kapakları hazırlamak, optik yakalama deneyleri için polistiren boncuklar hazırlamak ve doğrudan biyofiziksel manipülasyona izin verirken in vivo işlevlerini koruyan çapraz bağlı filament ağlarını bir araya getirmek için gereken adımları detaylandırıyoruz.

Protocol

1. Mikrotübüllerin hazırlanması NOT: GFP etiketli çapraz bağlama proteinleri kullanıldığında, kırmızı (örneğin, rodamin) ve uzak kırmızı (örneğin, biyotinile HiLyte647, metnin geri kalanında biyotinile edilmiş çok kırmızı olarak adlandırılır) mikrotübüllerin organik florofor etiketlemesi iyi çalışır. Görüntüleme sırasında yüksek kaliteli dörtlü bant toplam dahili yansıma floresan (TIRF) filtresi kullanılarak her üç kanal arasında m…

Representative Results

Biyofiziksel analiz için uygun mikrotübül demetlerinin hazırlanması, anahtar kriterlerin birçoğunun karşılanması durumunda başarılı kabul edilir. İlk olarak, üç renkte görüntüleme, tercihen örtüşme bölgesini süsleyen çapraz bağlama proteini konsantrasyonuna sahip iki hizalanmış mikrotübül ortaya çıkarmalıdır (Şekil 5B, C ve Şekil 6B). İdeal olarak, örtüşen kenar ile rodamin mikrotübülün…

Discussion

Mikrotübül ağları, doğada temel olarak mekanik olan çok çeşitli görevleri yerine getirmek için sayısız hücre tipi tarafından kullanılır. Hücrelerin hem sağlıklı hem de hastalık durumlarında nasıl çalıştığını tanımlamak için, bu mikron ölçekli ağların toplu olarak onları oluşturan nanometre boyutundaki proteinler tarafından nasıl organize edildiğini ve düzenlendiğini anlamak çok önemlidir. Optik cımbız gibi biyofiziksel araçlar, bu ölçekte anahtar proteinlerin mekanokimyas…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, R21 AG067436 (JP ve SF’ye), T32 AG057464 (ET’ye) ve Rensselaer Politeknik Enstitüsü Bilim Okulu Başlangıç Fonları’ndan (SF’ye) destek almak istemektedir.

Materials

10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide – CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide – GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915–96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Riferimenti

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biologia. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biologia. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. . SMART – Servier Medical ART Available from: https://smart.servier.com/ (2022)
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Microtubule BundlesCytoskeletal NetworksForce MeasurementOptical TrapTIRF MicroscopySingle-molecule ExperimentsProtein ConcentrationProtein DensityMitosisNeural DevelopmentMuscle ContractionCell MigrationStreptavidinNeutrAvidinCaseinBiotinylated MicrotubulesRhodamine MicrotubulesRigor Kinesin-coated BeadsReaction Buffer
check_url/it/63819?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citazione di questo articolo
Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).
Scarica citazione
Ristampe e autorizzazioni

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image