Il protocollo presenta un metodo per isolare lisati proteici di cellule intere da processi facciali embrionali di topo sezionati o cellule mesenchimali palatali embrionali di topo in coltura ed eseguire il successivo western blotting per valutare i livelli di proteine fosforilate.
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Articolo metodologico
Isolamento di lisati proteici a cellule intere da processi facciali di topo e cellule mesenchimali palatali coltivate per l'analisi delle fosfoproteine
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Questi cambiamenti morfologici sono iniziati e sostenuti attraverso diverse interazioni di segnalazione, che spesso includono la fosforilazione proteica da parte delle chinasi. Qui vengono forniti due esempi di contesti fisiologicamente rilevanti in cui studiare la fosforilazione delle proteine durante lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi: i processi facciali del topo, in particolare i processi mascellari E11.5, e le cellule mesenchimali palatali embrionali embrionali di topo in coltura derivate da scaffali palatali secondari E13.5. Per superare la barriera comune della defosforilazione durante l'isolamento proteico, vengono discussi gli adattamenti e le modifiche ai metodi di laboratorio standard che consentono l'isolamento delle fosfoproteine. Inoltre, vengono fornite le migliori pratiche per un'analisi e una quantificazione adeguate delle fosfoproteine a seguito del western blotting dei lisati proteici di cellule intere. Queste tecniche, in particolare in combinazione con inibitori farmacologici e/o modelli genetici murini, possono essere utilizzate per ottenere una maggiore comprensione delle dinamiche e dei ruoli di varie fosfoproteine attive durante lo sviluppo craniofacciale.
Introduzione
Lo sviluppo craniofacciale dei mammiferi è un processo morfologico complesso durante il quale più popolazioni cellulari si coordinano per generare lo scheletro frontonasale. Nel topo, questo processo inizia al giorno embrionale (E) 9.5 con la formazione della prominenza frontonasale e coppie di processi mascellari e mandibolari, ognuno dei quali contiene cellule della cresta neurale cranica post-migratoria. I processi nasali laterali e mediali derivano dalla prominenza frontonasale con la comparsa delle fosse nasali e alla fine si fondono per formare le narici. Inoltre, i processi nasali mediali e i processi mascellari si fondono per generare il labbro superiore. Allo....
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Colorado Anschutz Medical Campus ed eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti istituzionali. Per la raccolta di embrioni sono stati utilizzati topi femmina 129S4 a 1,5-6 mesi di età e alloggiati a una temperatura sub-termoneutrica di 21-23 °C. Un flusso di lavoro schematico del protocollo è rappresentato nella Figura 1. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature, il software, i reagenti e gli animali utilizzati in ....
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Risultati
Quando si tenta di caratterizzare la fosforilazione di proteine isolate da processi facciali di topo e/o cellule mesenchimali palatali in coltura, i risultati rappresentativi riveleranno idealmente una banda distinta e riproducibile dopo il western blotting con un anticorpo antifosfoproteico che corre all'altezza o vicino all'altezza della corrispondente banda proteica totale (Figura 3 ). Tuttavia, se si verifica un'estesa fosforilazione della proteina, potrebbe esserci un leggero spostament.......
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Discussione
Il protocollo qui descritto consente ai ricercatori di sondare eventi critici di segnalazione dipendenti dalla fosforilazione durante lo sviluppo craniofacciale in modo robusto e riproducibile. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo che garantiscono una corretta raccolta di dati e l'analisi dei risultati. Che si tratti di isolare le fosfoproteine dai processi facciali dei topi e / o dalle cellule mesenchimali palatali in coltura, è imperativo muoversi in modo rapido ed efficiente mantenendo tutti i reagent.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
129S4 topi sono stati un dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine del Monte Sinai. Questo lavoro è stato sostenuto con fondi dal National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 e K02 DE028572 a K.A.F., F31 DE029976 a M.A.R. e F31 DE029364 a B.J.C.D.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Equipment | |||
| Block per mini bagno a secco | Research Products International Corp | 400783 | |
| Sistema di imaging ChemiDoc XRS+ con software Image Lab | Bio-Rad | 1708265 | imager a chemiluminescenza |
| CO2 incubatore, camicia d'aria | VWR | 10810-902 | |
| scheda, 11 x 13 in | Fisher Scientific | 09 002 12 | |
| Cella di elettroforesi, 4 gel, per mini gel prefabbricati con modulo mini trans-blot | Bio-Rad | 1658030 | |
| Forno di ibridazione | Scientific | UVP95003001 | |
| Microcentrifuga 5415 D con rotore F45-24-11 (Eppendorf) | Sigma Aldrich | Z604062 | |
| Mini bagno secco | International Corp | 400780 | |
| Agitatore orbitale | VWR | 89032-092 | |
| Misuratore di pH | VWR | 89231-662 | |
| Alimentatore per SDS-PAGE | Bio-Rad | 1645050 | |
| Vaschetta di ghiaccio rettangolare, maxi 9 L | Fisher Scientific | 07-210-093 | |
| Stereomicroscopio Stemi 508 con supporto K LAB, luce anulare a LED | Zeiss | Microscopio | da dissezione |
| Timer | VWR | 62344-641 | |
| Revolver a tubo | Fisher Scientific | 11 676 341 | |
| Miscelatore a vortice | Fisher Scientific | 02 215 414 | |
| Bagno d'acqua | VWR | 89501-472 | |
| Western blot box | Fisher Scientific | NC9358182 | |
| Materiali | |||
| Piastre per colture cellulari, 6 cm | Fisher Scientific | 12-565-95 | |
| Piastre per colture cellulari, 12 pozzetti | Fisher Scientific | 07-200-82 | |
| Sollevatori cellulari | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| CO2 | Airgas | CD USP50 | |
| Provette coniche, polipropilene, 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| Dumont #5 pinze fini | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Cucchiaio per embrioni | Fine Science Tools | 10370-17 | |
| Provette per microcentrifuga, 0,5 mL | VWR | 89000-010 | |
| Provette per microcentrifuga, 1,5 mL | VWR | 20170-038 | |
| Pipetta Pasteur, 5,75" | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Pipetta Pasteur, 9" | VWR | 14672-380 | |
| piastre di Petri, 10 cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| Piastre di Petri, 35 mm | Fisher Scientific | FB0875711YZ | |
| Buste, trasparente, fodera in polietilene | Fisher Scientific | 01-812-25B | |
| Membrana PVDF | Fisher Scientific | IPVH00010 | |
| Pinza Semken | Fine Science Tools | 11008-13 | |
| Piccolo bulbo in lattice, 2 mL | VWR | 82024-554 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools | 14002-12 | |
| Filtro per siringa, 25 mm, 0,2 μ m pori Fisher | Scientific | 09-740-108 | |
| Siringa con punta luer, 10 mL | VWR | BD309604 | |
| Pipetta di trasferimento | Fisher Scientific | 13-711-22 | |
| Leva di apertura della cassetta Western blot | Bio-Rad | 4560000 | |
| Whatmann 3MM carta per cromatografia Chr | Fisher Scientific | 05-714-5 | |
| Reagenti | |||
| 4-15% Gel proteici prefabbricati, 10 pozzetti, 30 µ L | Bio-Rad | 4561083 | |
| β-glicerofosfato sale disodico idrato | Sigma Aldrich | G5422-25G | concentrazione madre 1 M |
| β-mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | M3148-100ML | |
| Albumina sierica bovina, frazione V, testata per shock termico | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blu di bromofenolo | Fisher Scientific | ||
| Cocktail completo di mini inibitori della proteasi | Sigma Aldrich | 11836153001 | concentrazione stock 25x |
| Kit di dosaggio delle proteine DC II | Bio-Rad | 500-0112 | |
| DMEM, Gibco ad alto contenuto di glucosio | 11965092 | ||
| E7, anticorpo primario beta tubulina monoclonale di topo, concentrato 0,1 mL | Studi sullo sviluppo Banca degli ibridomi | E7 | 1:1.000 |
| Substrato di blotting occidentale ECL | Fisher Scientific | PI32106 | substrato di |
| blotting occidentale ECL | Genesee Scientific | 20-302B | gamma di femtogrammi bassi |
| Tampone per elettroforesi, 5 L | Bio-Rad | 1610772 | concentrazione di stock 10x |
| etanolo, 200 proof, 1 gallone | Decon Laboratories, Inc. | 2705HC | EtOH |
| Acido etilendiamminotetraacetico, diidrico salino Di Na. (potenza cristallina/elettrofora.) | Fisher Scientific | BP120-500 | EDTA |
| Siero fetale bovino, caratterizzato, origine USA, 500 ml di | HyClone | SH30071.03 | |
| Glicerolo (certificato ACS) | Fisher Scientific | G33-4 | |
| Anticorpo secondario coniugato HRP, capra anti-topo IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 115-035-146 | 1:20.000 |
| HRP-66 anticorpo secondario coniugato HRP, capra anti-coniglio IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-003 | 1:20.000 |
| Soluzione di acido cloridrico, 6N (certificato) | Fisher Scientific | SA56-500 | HCl |
| Igepal Ca - 630 detergente non ionico | Fisher Scientific | ICN19859650 | Nonidet P-40 |
| Isopropanolo (HPLC) | Fisher Scientific | A451-1 | |
| L-glutammina | Gibco | 25030081 | concentrazione stock 200 mM |
| Metanolo | Fisher Scientific | A454-4 | |
| p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primario | Cell Signaling Technology | 9102S | 1:1.000; ligando ricombinante anti-Erk1/2 |
| PDGF-BB, ratto | Fisher Scientific | 520BB050 | |
| PDGF Receptor & beta; anticorpo primario | Cell Signaling Technology | 3169S | s1:1.000 |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | concentrazione madre 100 U/mL, 100 &; g/mL |
| Fenilmetansulfonilfluoruro, 99% | Scientific | AC215740100 | PMSF; concentrazione madre 100 mM |
| Fosfo-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorpo primario | Cell Signaling Technology | 9101S | 1:1.000, recettore anti-fosfo-Erk1/2 |
| Phospho-PDGF & alfa; /PDGF recettore & beta; anticorpo primario | Cell Signaling Technology | 3170S | 1:1.000 |
| Cloruro di potassio (cristalli bianchi) | Fisher Scientific | BP366-500 | KCl |
| Fosfato di potassio monobasico (cristalli bianchi) | Fisher Scientific | BP362-500 | KH2PO4 |
| SDS, 10% | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Cloruro di sodio (cristallino/biologico, certificato) | Fisher Scientific | S671-3 | NaCl |
| Fluoruro di sodio (polvere/certificato ACS) | Fisher Scientific | S299-100 | NaF; aliquota per un solo utilizzo; concentrazione madre 1 M |
| Ortovanadato di sodio, 99% | Fisher Scientific | AC205330500 | Na3VO4; concentrazione stock 100 mM |
| Fosfato di sodio bibasico anidro (granulare o in polvere/certificato ACS) | Fisher Scientific | S374-500 | Na2HPO4 |
| Coltura tissutale PBS | Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Tampone di trasferimento, 5 L | Bio-Rad | 1610771 | concentrazione stock 10x |
| base Tris (cristalli bianchi o polvere cristallina/biologia molecolare) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tripsina | BioWorld | 21560033 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Marcatore di peso molecolare Western blot | Bio-Rad | 1610374 | |
| Software | |||
| ImageJ software | National Institutes of Health | ||
| Animals | |||
| Female 129S4 topi | dono del Dr. Philippe Soriano, Icahn School of Medicine al Mount Sinai |
Riferimenti
- Bush, J. O., Jiang, R. Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development. Development. 139 (2), 231-243 (2012).
- Chai, Y., Ito, Y., Han, J. TGF-beta signaling a....
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Ristampe e permessi
