Polyp bail-out er en proces induceret af akut stress, hvor koralpolypper fordøjer vævet, der forbinder dem med deres koloni og løsner sig fra det for at leve som individer. Den nuværende protokol beskriver, hvordan man inducerer koralmikroformering ved hjælp af hypersalin- eller calciumfrie havvandsbehandlinger.
Koraller er koloniale dyr dannet af modulære enheder kaldet polypper. Koralpolypper er fysiologisk forbundet og forbundet med væv. Fænomenet polyp bail-out er en proces induceret af akut stress, hvor koralpolypper fordøjer vævet, der forbinder dem med resten af kolonien og i sidste ende løsner sig fra skelettet for at fortsætte med at leve som separate individer. Koralbiologer har anerkendt processen med polyp-bail-out i årevis, men først for nylig er de mikropropagater, der genereres af denne proces, blevet anerkendt som et modelsystem til koralbiologiske undersøgelser. Brugen af polyp bail-out kan skabe et stort antal klonale enheder fra et enkelt koralfragment. En anden fordel er, at enkeltpolypper eller pletter af polypper let kan visualiseres under et mikroskop og vedligeholdes i meget standardiserede lavprismiljøer såsom petriskåle, kolber og mikrofluidiske chips. Denne protokol demonstrerer reproducerbare metoder, der er i stand til at fremkalde koralmikroformering og forskellige tilgange til at holde de enkelte polypper i live på lang sigt. Denne metode var i stand til med succes at dyrke polypper af koralarten Pocillopora verrucosa i op til 8 uger efter bail-out og udstille det praktiske ved at bruge individuelle koralpolypper til koralforskning.
Scleractinian eller reef-building koraller er cnidarians, der er i stand til at danne karbonatskeletter, skabe rev og strukturelt komplekse økosystemer, der kan findes fra dybe til lavvandede miljøer1. Tropiske koralrev er vært for høj biodiversitet og leverer vigtige økosystemtjenester såsom kystbeskyttelse og fiskerivedligeholdelse2. De fleste lavvandede revbyggende koraller er afhængige af et mutualistisk forhold til alger af familien Symbiodiniaceae, som giver den energi, som koraller har brug for til at bygge deres skeletter. Symbiosen mellem korallerne og algerne kan brydes af miljøbelastning, hvilket forårsager koralblegning 3,4,5,6. Nylige temperaturanomalier har forårsaget store koralblegningshændelser rundt om i verden, hvilket har ført til massekoraldødelighed og permanent nedbrydning af rev 7,8,9,10,11. Da dette fænomen er baseret på udvisning af symbionter ved postvarmestressassocierede cellulære mekanismer, såsom apoptose, autofagi og exocytose, kan koralblegning beskrives som en cellulær proces, der har konsekvenser på økosystemskala 5,6,12, hvilket betyder at have in vitro-kulturer af koralceller eller væv ville være anvendelig til at studere dette fænomen nøje.
På grund af betydningen af koralrev og de store trusler, de har stået over for, især i de sidste to årtier2, er koraller blevet fokus for forskning til beskyttelse og restaureringsformål over hele verden13. Udviklingen af tilgange og eksperimentelle systemer, der er pålidelige, reproducerbare og tilbyder minimal miljøpåvirkning for at studere koraller, er imidlertid en stor kamp på dette område.
Mikroformering defineres som in vitro-proliferation af en organismes genotype ved dyrkning af dens biologiske materiale i kontrollerede beholdere14,15. Dyrkning af celler, væv og organer har været afgørende for plante- og dyrebiologi i de seneste årtier. Det tillader massegengivelse af organismer i laboratorier, hurtig vurdering af forskellige behandlinger (såsom lægemidler og lægemidler) og direkte undersøgelse af cellefunktion 14,15,16,17. Generelt har in vitro-modeller været nyttige til at supplere og uddybe undersøgelserne af forskellige organismer under bedre kontrollerede fysiske og kemiske forhold. På grund af fordelene ved in vitro-dyrkningsteknikker er forskellige dyrecelle- og vævskulturteknologier blevet udviklet, optimeret og brugt som vigtige værktøjer inden for mange forskningsområder, hvor flere cellelinjer er blevet undersøgt og kommercialiseret til adskillige anvendelser 16,17,18.
Mange fremskridt i viden om celle- og vævskultur er blevet gjort siden den første dyrevævskultur i 188217, såsom brugen af naturlige og syntetiske medier, opfindelsen af etablerede cellelinjer og udviklingen af 3D-medier til at dyrke en lang række celletyper på en bedre måde16,17, 18,19. Cellebiologiområdet har dog mest fokuseret på en udvalgt gruppe af modelorganismer, mens mange taxa stadig ikke har veletablerede in vitro-kulturer af celler, væv eller organer20. For eksempel er der i koralforskning ikke blevet brugt udødeliggjorte cellelinjer i vid udstrækning til forskning, hvilket begrænser koralcelleforskning til brugen af primære cellekulturer. Disse kulturer har levedygtighed begrænset til et par uger21, uden undersøgelser, der registrerer overlevelsen af individuelle celler fra alle koralvæv i mere end 13 dage indtil begyndelsen af 202122. Den første rapport om bæredygtige koralcellelinjer, der blev offentliggjort, var med Acropora tenuis-celler, der levede op til 6 måneder, og nytten af disse celler til fremtidig forskning skal stadig undersøges23.
For at overvinde begrænsningerne i dyrkning af koralcellekulturer og for at opretholde en laboratoriekultur, der bevarer korallernes overordnede vævsorganisation, er brugen af isolerede polypper for nylig blevet foreslået som en model for koralbiologisk forskning24,25. Polypper er de anatomiske enheder af koraller, og hver af dem har en mund placeret i midten af deres orale disk og er forbundet med andre polypper af coenosarc i sin aborale region26. Adskillelsen af levende polypper sker naturligt ved processen med polyp bail-out, hvor akut stress forårsager fordøjelsen af coenosarc mellem polypperne, som derefter kan løsne sig fra koloniens skelet 25,27,28. Dette fænomen er rapporteret at forekomme i en række taxa, herunder octocorals 29,30,31, sorte koraller32 og scleractinske koraller25,27,28,32,33, og har været forbundet med flere miljømæssige stressfaktorer, såsom mangel på calcium i vand 24,34, øget surhedsgrad 35, hyperosmotiske tilstande 25,27,32,36, høje temperaturer36,37, sult33, lufteksponering25,30 og insekticidforurening28,38. Polyp bail-out er for eksempel blevet rapporteret i pocilloporid koraller19, som er bredt fordelt over hele verden og er almindeligt anvendt som modeller i koralforskning. Arter, der tilhører denne gruppe, såsom Pocillopora damicornis og Styllophora pistillata, har genereret ca. 30-40 mikropropagater fra et 5 mm fragment25. Dette tal understreger fordelen ved at bruge polyp bail-out som en metode til koralmikroformering, da det skaber mulighed for at generere mange genetisk identiske individer fra et lille stykke koral. Brugen af isolerede polypper til forskning har også de samme fordele som cellekulturer med hensyn til muligheden for at blive dyrket i kontrollerede laboratoriemiljøer, såsom kolber og petriskåle. Derudover har mikrofluidiske platforme til vedligeholdelse af levende polypper vist, at disse mikropropagater kan opbevares i relativt billige og let reproducerende miljøer med kontrolleret vandstrøm, overflade og temperatur24,25. Disse mikrofluidiske platforme kan også bruges til at visualisere levende koralstrukturer under et mikroskop direkte24,25.
I denne artikel opsummerer og demonstrerer vi de teknikker, der er udviklet til at isolere individuelle koralpolypper fra deres kolonier, og viser, hvordan man opretholder dem under laboratorieforhold for langsigtet kultur. De diskuterede metoder omfatter polyp bail-out gennem hyperosmotiske forhold ved fordampning og pumpning af havvand med høj saltholdighed og inkubation i calciumfrit havvand.
Polyppers overlevelsesrate efter at være blevet underkastet redningsprocesser og den tid, der er nødvendig for processen, der skal afsluttes, varierer blandt tidligere rapporterede undersøgelser 25,33,41, hvilket muligvis forklares af de forskellige eksperimentelle tilgange, der anvendes i hver undersøgelse. For eksempel præsenterer forskellige koralarter eller endda koraller fra samme art, men akklimatiseret til forskellige miljøforhold (f.eks. Koraller fra Rødehavet), forskellige tærskler for saltholdighedsniveauer. Den valgte redningsmetode og laboratorie-/akvarieforholdene spiller også en vigtig rolle i resultaterne. I nogle tilfælde har vedligeholdelsen af koralmikropropagater under laboratorieforhold overgået overlevelsestiden for koralcellekulturer ved at nå måneders overlevelse i azooxanthellat3 3,41 og zooxanthellat25 koraller. Tidspunktet for, hvornår polyp-bail-out-processen er afsluttet, har også varieret i forskellige undersøgelser, der spænder fra et par timer2 5,2 7,30 til uge35 inkubation udsat for den stressor, der er ansvarlig for at forårsage bail-out. En anden variabel, der skal tages i betragtning ved undersøgelse af polyp-bail-out, er genopretningen af polypperne efter eksponering for den akutte stress, der udløste deres frigivelse. Det kan stadig diskuteres, om polypper efter bail-out er i god nok stand til at blive brugt som modeller til at studere koralbiologi. Genopretningen af deres væv efter nedbrydningen af coenosarc er et spørgsmål om bekymring, når disse mikropropagater anvendes. Imidlertid har polypper i mange undersøgelser, herunder nutiden, været i stand til at præsentere zooxanthellae celler inde i deres væv og eksterne morfologier med intakt oral-aboral polarisering og tentakler uger efter bail-out 25,27,32,36. Tidligere undersøgelser har også vist, at frigivne koralpolypper udsat for stærkt saltvand eller opvarmet havvand efter at være blevet lettet fra akut stress har været i stand til at genvinde ekspressionen af gener relateret til processer som apoptose, proteolyse og celledeling til niveauer svarende til dem, der blev fundet før bail-out32,36 og endda for at øge ekspressionen af gener relateret til vævsheling36.
Med hensyn til forskellen i overlevelse mellem metoder er det vigtigt at fremhæve, at denne tid kan variere mellem forskellige eksperimenter, selvom de samme teknikker anvendes, og det kan relateres til sundheden for de anvendte fragmenter og korrekt vedligeholdelse af polypperne efter bail-out-processen. I tilfælde af bail-out gennem calciumfri havvand inkubation var polyp overlevelse begrænset til 1 dag. Det kan således konkluderes, at metoden ikke er velegnet til den undersøgte arts langsigtede overlevelse, eller der skal foretages en bedre tilpasning af teknikken til P. verrucosa koraller fra Rødehavet. De rapporterede resultater viste, at der blev opnået en længere overlevelsestid med metoderne baseret på den gradvise stigning i saltholdigheden, når polypperne blev udsat for dryp af vand med høj saltholdighed. Denne metode kan levere en mere kontrolleret stigning i saltholdigheden end fordampningsmetoden, samtidig med at den ikke er ansvarlig for en stigning i koncentrationen af andre stoffer, der findes i havvandet, herunder koralens metaboliske affald, som er potentielt giftigt for organismen. Af alle disse grunde er denne metode blevet foreslået som et sikrere alternativ til opretholdelse af sunde polypper27. Selvom denne metode er blevet antaget at være sikrere for polyp sundhed og i stand til at producere polypper, der lever længere, en kendsgerning, der blev bekræftet i denne nuværende publikation, er der behov for yderligere undersøgelser for at bekræfte det. Begge højsaltholdighedsinducerede redningsforsøg viste en fuldstændig løsrivelse af polypper, efter at saltholdigheden nåede 59 PSU i 24 timer. Hvis saltholdigheden øges ud over det niveau, hvor redningspakken er afsluttet, vil polypperne blive yderligere stresset, hvilket reducerer deres chance for at overleve og komme sig efter den akutte stressbehandling. Derfor anbefales det ikke at opretholde polypperne længere i sådanne saltholdighedsniveauer. Ved udførelse af bail-out induktionsmetoden ved eksponering for calciumfrit havvand blev der opnået en komplet løsrivelse fra en 3 timers inkubation i calciumfrit kunstigt havvand, hvilket betyder, at yderligere eksponering for dette medium heller ikke anbefales.
For at adressere de metoder, der var mere passende til undersøgelse af koralpolypper i laboratorie- / in vitro-undersøgelser , fokuserede denne undersøgelse kun på tre procedurer, der tog tæt på 24 timer for redningsprocessen at være afsluttet og blev brugt i undersøgelser, der involverede langsigtet vedligeholdelse af koralpolypper fra scleractinske koraller. Andre metoder, der rapporterede at tage betydeligt længere tid end denne gang, blev ikke anvendt. Aflejring af polypper til et substrat blev ikke forsøgt i denne undersøgelse, som fokuserede på at producere polypper, der kunne overføres til forskellige miljøer eller let indsamles til analyser ved hjælp af engangspipetter. Resultaterne viser, at polypper fra koralarten P. verrucosa blev holdt i live med tilhørende zooxanthellae-celler, sund visuel status og en bevaret grov ydre anatomisk struktur i op til 8 uger, selv uden fastgørelse til et substrat. Disse resultater indikerer, at flere biologiske replikater kan genereres fra enkelte koralfragmenter ved hjælp af nogle af de teknikker, der er demonstreret i denne undersøgelse. Sådanne biologiske replikater kan opbevares i kontrollerede miljøer (såsom petriskåle og cellekolber) og opbevares under laboratorieforhold til månedlange forsøg og anvendes til flere formål.
Siden de første tilfældige beskrivelser af polyp bail-out 42,43 er der etableret nye protokoller for at finde mere standardiserede metoder til at fremkalde polypfrigivelse og opretholde sådanne polypper i live, som kan bruges til fremtidige forskningsapplikationer. Disse omfatter undersøgelse af forskellige aspekter forbundet med koral holobiont fysiologi44 og vært-mikrobiom interaktioner45, de molekylære mekanismer involveret i koralblegning 5,25, og sundhed, modstandsdygtighed og beskyttelse af koral holobiont 12,13,46,47 . Desuden kan frigivne koralpolypper bruges til applikationer uden for forskningens område og er blevet foreslået at være nyttige til at skabe propaguler, der kan fastgøres til et substrat og vokse, hvilket potentielt skaber flere koralindivider, der kan bruges til restaureringsformål, når standardiserede protokoller til redning bliver udbredt28 . Samlet set, selvom mere dybtgående eksperimenter ved hjælp af bailed-out polypper bør udføres for at standardisere metoden, har det vist sig, at polyp bail-out er en reproducerbar tilgang, der kan anvendes som et værktøj i koralforskning til flere formål.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Adam Barno og Francisca Garcia for deres støtte i eksperimenterne og overvågningen af koralpolypperne. Vi takker også KAUST Coastal &Marine Resources Core Lab for deres hjælp vedrørende akvarievedligeholdelse og infrastruktur. Undersøgelsen blev finansieret af KAUST-tilskudsnummer BAS/1/1095-01-01.
5560 Conductivity/Temperature Probe | YSI | 5560 | Conductivity probe used with the ProQuatro Multiparameter meter |
Ace 5 in. Alloy Steel Diagonal Pliers | Ace Hardware | 2004083 | Used to cut coral fragments |
Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | Used in DMEM medium. |
DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41965-039 | Used for incubating coral fragments in the calcium-free polyp bail-out method |
Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, Polystyrene | Thermo Fisher Scientific | FB0875713A | Petri dish used for bail-out by evaporstion and for keeping polyps inside an aquarium. |
Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600 Watt | Schego | 548 | Heaters used in aquarium |
Leica Application Suite Version 4.2 | Leica Microsystems | NA | Software used for image capture in demonstrative results |
Leica IC80 HD | Leica Microsystems | 12730216 | Camera used to take demonstrative results pictures |
Leica MDG33 | Leica Microsystems | 10 450 123 | Stereoscope stand used to take demonstrative results pictures |
Leica Z6 APO | Leica Microsystems | NA | Macroscope used to take demonstrative results pictures |
Magnesium Chloride | Thermo Fisher Scientific | 7487-88-9 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Magnesium Sulfate Anhydrous | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Masterflex I/P Easy-Load Pump Head for Precision Tubing, White PPS Housing, SS Rotor | Masterflex | HV-77602-10 | Peristaltic pump head. |
Masterflex L/S Precision Modular Drives with Benchtop Controller | Masterflex | EW-07557-00 | Peristaltic pump drive used for pumping high salinity seawater. Can be substituted for any peristaltic pump capable of mainaining water flow as described in protocol. |
Masterflex L/S Precision Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone, L/S 16; 25 ft | Masterflex | HV-96410-16 | Tubing for peristaltic pump. |
Millex 33 mm PVDF 0.22 µm Sterile RUO | Sigma-Aldrich | SLGVR33RS | Used to filter artificial sea water. |
Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface | Thermo Fisher Scientific | 156499 | Flask usually used for cell culture used for polyp culture. |
Orbital shaker, Advanced 5000, VWR | VWR | 444-2916 | Shaker used inside incubator. |
Percival Incubator – I-22VL | Percival | NA | Incubator used for maintaing corals kept in cell flasks. |
Plankton net 200 µm mesh size | KC Denmark | NA | Used for covering petri dishes containing coral polyps. |
Potassium Chloride | VWR Chemicals | 7447-40-7 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
ProQuatro Multiparameter Meter | YSI | 606950 | Used for measuring salinity thoughout the protocol |
RADION XR15 G5 PRO | Ecotech | NA | Lights used in aquarium |
Red Sea Salt Premium grade, moderate Alkalinity |
Red Sea | NA | Used to prepare 40 PSU artifical sea water. |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
Sodium Sulfate Anhydrous | VWR Chemicals | 7757-82-6 | Used for preparing calcium-free artificial seawater. |
TRD 112 thermostat | Schego | NA | Thermostat used in aquarium |
Turbelle Nanostream 6025 | Tunze | 6025 000 | Pumps used in aquarium |