عزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض من البعوض الذي تم جمعه في الحقول
Summary
تم العثور على العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض بسبب الاستخدام المكثف لتقنيات التسلسل. نحن نقدم إجراء فعالا لعزل الفيروسات وتضخيمها باستخدام الفقاريات وخطوط خلايا البعوض ، والتي قد تكون بمثابة أساس للدراسات المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك الفيروسات التي ينقلها البعوض والفيروسات الخاصة بالبعوض.
Abstract
مع التطبيق الواسع لتقنيات التسلسل ، تم اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في المفصليات ، بما في ذلك البعوض. الفئتان الرئيسيتان لهذه الفيروسات الجديدة المرتبطة بالبعوض هما “الفيروسات التي ينقلها البعوض (MBVs)” و “الفيروسات الخاصة بالبعوض (MSVs)”. قد تكون هذه الفيروسات الجديدة مسببة للأمراض لكل من الفقاريات والبعوض ، أو يمكن أن تكون تكافلية مع البعوض. فيروسات الكيانات ضرورية لتأكيد الخصائص البيولوجية لهذه الفيروسات. وبالتالي ، تم وصف بروتوكول مفصل هنا لعزل الفيروس وتضخيمه من البعوض الذي تم جمعه ميدانيا. أولا ، تم تحضير عينات البعوض كطاف لمتجانسات البعوض. بعد الطرد المركزي مرتين ، تم بعد ذلك تلقيح المواد الطافية إما في خط خلايا البعوض C6 / 36 أو خط خلايا الفقاريات BHK-21 لتضخيم الفيروس. بعد 7 أيام ، تم جمع المواد الطافية كمواد طافية P1 وتخزينها عند -80 درجة مئوية. بعد ذلك ، تم تمرير طافات P1 مرتين أخريين في خلايا C6 / 36 أو BHK-21 أثناء فحص حالة الخلية يوميا. عندما تم اكتشاف التأثير الممرض الخلوي (CPE) على الخلايا ، تم جمع هذه المواد الطافية واستخدامها لتحديد الفيروسات. يعمل هذا البروتوكول كأساس للبحوث المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك MBVs و MSVs.
Introduction
البعوض هي مجموعة من ناقلات المفصليات المسببة للأمراض الهامة. هناك ما يقرب من 3500 نوع من البعوض في عائلة Culicidae1،2. أدى تطوير تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية إلى اكتشاف العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض من أجزاء مختلفة من العالم3. بشكل عام ، يمكن تصنيف هذه الفيروسات المرتبطة بالبعوض إلى مجموعتين رئيسيتين: MBVs و MSVs.
MBVs هي مجموعة من الفيروسات المتنوعة التي تعد عوامل مسببة للعديد من الأمراض البشرية أو الحيوانية ، مثل فيروس الحمى الصفراء (YFV) وفيروس حمى الضنك (DENV) وفيروس التهاب الدماغ الياباني (JEV) وفيروس غرب النيل (WNV) وفيروس حمى الوادي المتصدع (RVFV)4. لقد هددت الصحة العامة بشكل خطير من خلال التسبب في مراضة ووفيات شديدة لكل من البشر والحيوانات في جميع أنحاء العالم. تحافظ MBVs بشكل طبيعي على دورة حياة بين مضيفين متنوعين من خلال الانتقال من بعوضة مصابة إلى مضيف ساذج ، وكذلك من مضيف مصاب بالفيروس وإلى بعوضة تتغذى5. لذلك ، يمكن لهذه الفيروسات أن تصيب كلا من خطوط خلايا البعوض وخطوط خلايا الفقاريات في المختبر1.
MSVs ، والتي تشمل فيروس Yichang (YCN) ، وفيروس Culex flavivirus (CxFV) ، وفيروس Chaoyang (CHAOV) ، هي مجموعة فرعية من الفيروسات الخاصة بالحشرات1،6،7. في السنوات الأخيرة ، كان هناك ارتفاع في اكتشاف MSVs الجديدة ، وقد وجد أن بعض هذه MSVs لها تأثير على انتقال MBVs. على سبيل المثال ، يمكن ل CxFV ، الذي يمكن أن يكون عدوى مستمرة في Culex pipiens، قمع تكرار WNV في مرحلة مبكرة8. وقد وجد أن فيروسا فلافيا آخر خاصا بالحشرات، وهو فيروس عامل الالتحام الخلوي (CFAV)، يمنع انتشار فيروس حمى الضنك وفيروس زيكا في بعوضة الزاعجة المصرية 9. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول هو نهج مفيد لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض ويمكن أن يساعد في مزيد من البحوث في توزيع مسببات الأمراض المتعلقة بالبعوض ومكافحة الأمراض التي ينقلها البعوض.
Protocol
Representative Results
Discussion
كان الهدف من هذه الطريقة هو تقديم طريقة عملية لعزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض باستخدام خطوط الخلايا المختلفة. من الأهمية بمكان إضافة المضادات الحيوية ومضادات الفطريات (البنسلين – الستربتومايسين – الأمفوتريسين) إلى المواد الطافية لمتجانسات البعوض لتجنب التلوث بالبكتيريا أو الفطريات. يجب…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل مشروع خطة ووهان للعلوم والتكنولوجيا (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Riferimenti
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
