Myggassosiert virusisolering fra feltinnsamlede mygg
Summary
Tallrike nye viruslignende sekvenser har blitt funnet i mygg på grunn av den omfattende bruken av sekvenseringsteknologier. Vi tilbyr en effektiv prosedyre for å isolere og forsterke virus ved hjelp av virveldyr og myggcellelinjer, som kan tjene som grunnlag for fremtidige studier på myggassosierte virus, inkludert myggbårne og myggspesifikke virus.
Abstract
Med den brede anvendelsen av sekvenseringsteknologier har mange nye viruslignende sekvenser blitt oppdaget i leddyr, inkludert mygg. De to hovedkategoriene av disse nye myggassosierte virusene er “myggbårne virus (MBV)” og “myggspesifikke virus (MSV)”. Disse nye virusene kan være patogene for både vertebrater og mygg, eller de kan bare være symbiotiske med mygg. Entitetsvirus er avgjørende for å bekrefte de biologiske tegnene til disse virusene. Det er derfor beskrevet en detaljert protokoll her for virusisolering og amplifisering fra feltinnsamlet mygg. Først ble myggprøvene fremstilt som supernatanter av mygghomogenater. Etter sentrifugering to ganger ble supernatantene deretter inokulert i enten myggcellelinje C6/36 eller virveldyrcellelinje BHK-21 for virusforsterkning. Etter 7 dager ble supernatantene samlet som P1-supernatanter og lagret ved -80 °C. Deretter ble P1-supernatanter passert to ganger til i C6/36- eller BHK-21-celler mens cellestatusen ble sjekket daglig. Når cytopatogen effekt (CPE) på cellene ble oppdaget, ble disse supernatantene samlet og brukt til å identifisere virus. Denne protokollen tjener som grunnlag for fremtidig forskning på myggassosierte virus, inkludert MBV og MSV.
Introduction
Mygg er en gruppe viktige patogene leddyrvektorer. Det er ca. 3 500 myggarter i familien Culicidae 1,2. Utviklingen av høykapasitets sekvenseringsteknologier har ført til oppdagelsen av mange nye, viruslignende sekvenser i mygg fra forskjellige deler av verden3. Vanligvis kan disse myggassosierte virusene klassifiseres i to hovedgrupper: MBV og MSV.
MBV er en gruppe forskjellige virus som er årsaksmessige midler til mange sykdommer hos mennesker eller dyr, for eksempel gulfebervirus (YFV), denguevirus (DENV), japansk encefalittvirus (JEV), West Nile-virus (WNV) og Rift Valley febervirus (RVFV)4. De har alvorlig truet folkehelsen ved å forårsake alvorlig sykelighet og dødelighet hos både mennesker og dyr over hele verden. MBV-er opprettholder naturlig en livssyklus mellom ulike verter gjennom overføring fra en infisert mygg til en naiv vert, samt fra en virusinfisert vert og til en fôringsmygg5. Derfor kan disse virusene infisere både myggcellelinjer og virveldyrcellelinjer i laboratoriet1.
MSVer, som inkluderer Yichang-virus (YCN), Culex flavivirus (CxFV) og Chaoyang-virus (CHAOV), er en undergruppe av insektspesifikke virus 1,6,7. I de senere år har det vært en økning i oppdagelsen av nye muskel- og skjelettlidelser, og noen av disse muskel- og skjelettbedriftene har vist seg å ha innvirkning på overføringen av MBV. For eksempel kan CxFV, som kan være en vedvarende infeksjon i Culex pipiens, undertrykke WNV-replikasjon på et tidlig stadium8. Et annet insektspesifikt flavivirus, cellefusjonsmiddelvirus (CFAV), har vist seg å hemme forplantningen av DENV og Zika-virus (ZIKV) i Aedes aegypti-mygg 9. Dermed er denne protokollen en nyttig tilnærming for å isolere myggassosierte virus og kan bidra til videre forskning på fordelingen av patogener relatert til mygg og kontroll av myggbårne sykdommer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denne metoden var å tilby en praktisk måte å isolere myggassosierte virus ved hjelp av forskjellige cellelinjer. Det er viktig å legge til antibiotika-antimykotisk (Penicillin-Streptomycin-Amphotericin) til supernatanter av mygghomogenatene for å unngå forurensning av bakterier eller sopp. Mygg og virale supernatanter oppnådd i felt må oppbevares i kjøleskap ved -80 °C for å unngå gjentatte fryse-tine-sykluser.
Et annet kritisk skritt i protokollen var sliping. Myggprøv…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| 0.22 µm membrane filter | Millipore | SLGP033RB | Polymer films with specific pore ratings.To remove cell debris and bacteria. |
| 24-well plates | CORNING | 3524 | Containers for cell |
| 75 cm2 flasks | CORNING | 430641 | Containers for cell |
| a sterile 2 mL tube with 3 mm ceramic beads | |||
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-062 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria and fungi |
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | Instrument for centrifugation of mosquito samples |
| CO2 | |||
| Dulbecco’s minimal essential medium (DMEM) | Gibco | C11995500BT | medium for vertebrate cell lines |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Feta Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10099141C | Provide nutrition for cells |
| high-speed low-temperature tissue homogenizer | servicebio | KZ-III-F | Instrument for grinding |
| incubator (28 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| incubator (37 °C) | Panasonic | MCO-18AC | Instrument for cell culture |
| PCR tube | |||
| penicillin-streptomycin | Gibco | 15410-122 | Antibiotic in the medium to prevent contamination from bacteria |
| Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution | Gibco | 15240096 | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) | Gibco | C11875500BT | medium for mosiquto cell lines |
| Screw cap storage tubes (2 mL) | biofil | FCT010005 | |
| sterile pestles | Tiangen | OSE-Y004 | Consumables for grinding |
| TGrinder OSE-Y30 electric tissue grinder | Tiangen | OSE-Y30 | Instrument for grinding |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| the light traps MXA-02 | Maxttrac | ||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| The QIAamp viral RNA mini kit | QIAGEN | 52906 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Riferimenti
- Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. Mosquito-associated viruses in China. Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).
- Atoni, E., et al. A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China. Scientific Data. 7 (1), 342 (2020).
- Atoni, E., et al. The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017). Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079 (2019).
- Xia, H., et al. Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China. Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).
- Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review. Viruses. 13 (2), 265 (2021).
- Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. Mosquito-specific viruses-transmission and interaction. Viruses. 11 (9), 873 (2019).
- Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense. Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).
- Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus. Virology. 427 (2), 90-97 (2012).
- Baidaliuk, A., et al. Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo. Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).
- Atoni, E., et al. Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China. Viruses. 10 (1), 30 (2018).
- Xia, H., et al. First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China. Viruses. 10 (10), 555 (2018).
- Shi, C., et al. Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes. mSystems. 5 (5), 00640 (2020).
- Zhou, M., Chu, H. . Handbook for Classification and Identification of Main Vectors. , (2019).
- Wang, G., et al. Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding. Plos One. 7 (10), (2012).
- Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org). Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).
- Huang, Y., et al. In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides. Viruses. 14 (6), 1298 (2022).
- Zhao, L., et al. Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China. Frontiers in Microbiology. 10, 1963 (1963).
- Ren, N., et al. Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China. Journal of General Virology. 102 (9), 001645 (2021).
