조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조
Summary
본 프로토콜은 키토산-제니핀 마이크로겔의 제조를 위한 비에멀젼 기반 방법을 기술한다. 이러한 마이크로겔의 크기는 정밀하게 조절할 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 표시하고, 생체내에서 분해되며, 시간이 지남에 따라 지속적으로 방출되는 치료 분자로 로딩될 수 있어 조직 공학 응용에 매우 적합합니다.
Abstract
키토산 마이크로젤은 광범위한 응용, 저비용 및 면역원성으로 인해 조직 공학에 상당한 관심을 받고 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤은 일반적으로 독성이 강하고 환경에 해로운 유기 용매 헹굼이 필요한 에멀젼 방법을 사용하여 제조됩니다. 본 프로토콜은 유기 용매 린스없이 키토산-제니핀 마이크로겔을 제조하기 위한 신속하고, 세포독성이 없는, 비에멀젼-기반 방법을 제시한다. 본원에 기재된 마이크로겔은 정밀한 크기 조절을 통해 제조될 수 있다. 그들은 생체 분자의 지속적인 방출을 나타내므로 조직 공학, 생체 재료 및 재생 의학과 매우 관련이 있습니다. 키토산은 제니핀과 가교되어 하이드로겔 네트워크를 형성하고, 이어서 주사기 필터를 통과시켜 마이크로겔을 생성한다. 마이크로겔은 여과되어 다양한 크기를 만들 수 있으며, pH 의존적 팽윤을 나타내며 시간이 지남에 따라 효소적으로 분해됩니다. 이들 마이크로겔은 래트 성장 플레이트 손상 모델에 사용되었으며, 증가된 연골 조직 수복을 촉진하고 생체내에서 28일째에 완전한 분해를 나타내는 것으로 입증되었다. 저렴한 비용, 높은 편의성 및 세포 적합성 재료로 쉽게 제조 할 수 있기 때문에이 키토산 마이크로 젤은 조직 공학에서 흥미롭고 독특한 기술을 제시합니다.
Introduction
physis라고도 알려진 성장 판은 어린이의 성장을 매개하는 긴 뼈의 끝에 위치한 연골 구조입니다. 성장 플레이트가 손상되면 “뼈 막대”로 알려진 복구 조직이 형성 될 수 있으며, 이는 정상적인 성장을 방해하고 성장 결함이나 각형 기형을 유발할 수 있습니다. 역학 자료에 따르면 모든 어린 시절의 골격 손상의 15 % -30 %가 성장판과 관련이 있습니다. 보니 바 형성은 이러한 부상의 최대 30 %에서 발생하며, 성장 판 손상 및 관련 치료를 중요한 임상 징후 문제 1,2,3,4로 만듭니다. 뼈 막대 형성이 발생할 때, 가장 일반적인 치료 방법은 뼈 막대를 절제하고 실리콘 또는 지방 조직과 같은 삽입 물질을 삽입하는 것을 포함한다5. 그러나, 뼈 바 절제술 수술을 받는 환자들은 현재 부상당한 성장판6,7,8을 완전히 복구할 수 있는 치료법이 없기 때문에 완전한 회복을 위한 예후가 좋지 않은 경우가 많다. 이러한 단점에 비추어 볼 때, 뼈 막대의 형성을 방지하고 건강한 피씰 연골 조직을 재생시키는 데 모두 성장 판 부상을 치료하기위한 효과적인 전략이 절실히 필요합니다.
하이드로겔 마이크로입자, 또는 마이크로겔은 최근 치료제9의 지속적인 방출을 제공할 수 있는 주사용 스캐폴드로서 주목을 받고 있다. 높은 튜닝 가능성과 생체 적합성으로 인해 마이크로 젤은 생리 활성 인자 또는 세포 캡슐화에도 적합합니다. 마이크로겔은 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 합성 중합체에서부터 알지네이트 또는 키토산10,11,12와 같은 천연 중합체에 이르기까지 다양한 물질로 제조될 수 있다. 키토산은 그람 음성 박테리아의 외막을 불안정하게 하는 능력과 같은 조직 공학에 몇 가지 유익한 효과가 있는 것으로 밝혀져 있으며, 이로써 내재된 항균 활성1 3,14를 제공한다. 추가적으로, 키토산은 비용 효율적이고, 세포-상호작용적이며, 아민 함유 구조를 사용하여 쉽게 변형된다. 키토산 기반 마이크로젤은 박테리아 감염을 예방하면서 조직 재생을 촉진할 수 있는 약물 전달 및 물질 신호전달을 위한 생체재료 전략을 약속합니다. 그러나, 키토산 마이크로겔은 종종 특별한 장비, 에멀젼 기술, 또는 세포독성 용매 헹굼을 필요로 하는 광범위한 기술로 제조된다. 예를 들어, 일부 연구는 에멀젼 기반 방법으로 키토산 마이크로 젤을 제조했지만, 이러한 프로토콜은 용매 헹굼과 세포독성 가교제를 필요로하므로 잠재적으로 임상 설정15,16으로의 번역을 부정 할 수 있습니다. 다른 연구에서는 특수 장비, 준비 및 훈련이 필요한 키토산 마이크로 젤을 제조하기 위해 마이크로 유체 공학 또는 전기 분무 접근법을 사용했습니다17,18. 키토산 마이크로겔은 또한 일반적으로 키토산 용액으로 가교결합제를 적하 처리하여 제조된다; 그러나, 이 방법은 용액 점도, 중합체 농도 및 유량에 크게 의존하여, 마이크로겔(19,20)의 크기 및 분산도를 제어하기 어렵게 만든다. 반대로, 본원에 기재된 마이크로겔 제조 방법은 전문 장비 또는 용매 헹굼을 필요로 하지 않으며, 이들 마이크로겔을 거의 모든 실험실 또는 환경에서 제조를 위해 실행 가능하게 만든다. 따라서, 이들 마이크로겔은 많은 응용을 위한 신속하고, 비용 효율적이며, 생산하기 쉬운 약물 전달 비히클을 위한 고도로 관련된 생체 물질을 나타낸다.
마이크로겔의 조성과 물질 특성을 조절함으로써 연구자들은 세포 미세 환경을 정밀하게 제어하여 물질 의존적 방식으로 세포 거동을 지시 할 수 있습니다. 마이크로겔은 자체적으로 사용되거나 벌크 생체재료 시스템과 결합하여 생체활성 인자의 연장된 방출 또는 천연 또는 외인성 세포에 대한 정확한 특수 신호전달과 같은 특정 기능을 부여할 수 있다. 생체 재료 및 마이크로 젤은 성장 플레이트 부상에 대한 매력적인 치료 방법으로 부상했습니다. 성장 플레이트 부상21,22,23,24,25를 치료하기 위해 알긴산염 및 키토산 기반 생체 재료 개발에 상당한 노력을 기울여 왔습니다. 성장 판 골화 및 뼈 신장의 역동적 인 시간적 특성으로 인해, 뼈 막대 형성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않았습니다. 따라서, 쥐, 토끼 및 양 26,27,28에서와 같은 내연골 골화 및 뼈 바 형성의 메카니즘을 더 잘 해명하기 위해 몇몇 동물 모델이 개발되었다. 하나의 그러한 모델은 래트 성장 플레이트 손상 모델이며, 이는 래트 경골의 드릴 홀 결함을 사용하여 예측 가능하고 재현 가능한 방식으로 뼈 바를 생성하고 성장 플레이트29,30의 세 구역 모두에 걸쳐 인간 부상을 모방한다. 성장 플레이트 부상을 치료하기위한 몇 가지 생체 재료 기반 전략이이 모델을 사용하여 테스트되었습니다. 추가적으로, 키토산 마이크로겔을 제조하기 위한 두 가지 상이한 방법이 개발되었으며, 이는 지속적인 방식으로 치료제를 방출하는 주사 가능한 생체 재료 시스템으로서 사용될 수 있다10,31. 이들 마이크로겔은 래트 피씰 손상 모델에 사용되었으며, SDF-1a 및 TGF-b3을 방출할 때 개선된 연골 재생(31)을 보였다. 이 프로토콜에 제공된 기술은 이러한 키토산 마이크로겔을 제조하기 위해 개발된 방법을 기술하며, 이는 매우 다양한 조직 공학 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 최근의 연구들은 조절된 종양학적 약물 전달 응용을 위해 열- 또는 마젠토-반응성 키토산 마이크로겔을 사용하였다(32,33).
Protocol
Representative Results
Discussion
마이크로겔은 약물 전달 또는 세포 캡슐화9와 같은 다양한 목적을 위한 높은 수준의 적용성으로 인해 최근 몇 년 동안 널리 연구되고 있다. 마이크로 스케일 생체 재료 구축물의 제조 용이성은 연구자가 특정 크기와 시간 규모로 하이드로 겔 기반 전략을 개발할 수 있기 때문에 조직 공학에서 중요한 관련이 있습니다. 그러나 키토산 마이크로 젤을 제조하는 대부분의 방법은 값 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에보고 된 연구는 국립 보건원 (National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases)의 국립 관절염 및 근골격계 및 피부 질환 연구소가 수상 번호 R03AR068087 및 R21AR071585와 Boettcher Foundation (#11219)이 MDK에 지원했습니다. CBE는 NIH / NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081의 지원을 받았습니다.
Materials
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
Riferimenti
- Mizuta, T., Benson, W. M., Foster, B. K., Morris, L. L. Statistical analysis of the incidence of physeal injuries. Journal of Pediatric Orthopaedics. 7 (5), 518-523 (1987).
- Mann, D. C., Rajmaira, S. Distribution of physeal and nonphyseal fractures in 2,650 long-bone fractures in children aged 0-16 years. Journal of Pediatric Orthopaedics. 10 (6), 713-716 (1990).
- Eid, A. M., Hafez, M. A. Traumatic injuries of the distal femoral physis. Retrospective study on 151 cases. Injury. 33 (3), 251-255 (2002).
- Barmada, A., Gaynor, T., Mubarak, S. J. Premature physeal closure following distal tibia physeal fractures: a new radiographic predictor. Journal of Pediatric Orthopaedics. 23 (6), 733-739 (2003).
- Shaw, N., et al. Regenerative medicine approaches for the treatment of pediatric physeal injuries. Tissue Engineering Part B: Reviews. 24 (2), 85-97 (2018).
- Dabash, S., Prabhakar, G., Potter, E., Thabet, A. M., Abdelgawad, A., Heinrich, S. Management of growth arrest: current practice and future directions. Journal of Clinical Orthopaedics and Trauma. 9, 58-66 (2018).
- Williamson, R. V., Staheli, L. T. Partial physeal growth arrest: treatment by bridge resection and fat interposition. Journal of Pediatric Orthopedics. 10 (6), 769-776 (1990).
- Escott, B. G., Kelley, S. P. Management of traumatic physeal growth arrest. Orthopaedics and Trauma. 26 (3), 200-211 (2012).
- Newsom, J. P., Payne, K. A., Krebs, M. D. Microgels: modular, tunable constructs for tissue regeneration. Acta Biomaterialia. 88, 32-41 (2019).
- Riederer, M. S., Requist, B. D., Payne, K. A., Way, J. D., Krebs, M. D. Injectable and microporous scaffold of densely-packed, growth factor-encapsulating chitosan microgels. Carbohydrate Polymers. 152, 792-801 (2016).
- Xin, S., Wyman, O. M., Alge, D. L. Assembly of PEG microgels into porous cell-instructive 3D scaffolds via thiol-ene click chemistry. Advanced Healthcare Materials. 7 (11), 1800160 (2018).
- Kim, P. -. H., et al. Injectable multifunctional microgel encapsulating outgrowth endothelial cells and growth factors for enhanced neovascularization. Journal of Controlled Release. 187, 1-13 (2014).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E. -. T., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
- Sarmento, B., Goycoolea, F. M., Sosnik, A., das Neves, J. Chitosan and chitosan derivatives for biological applications: chemistry and functionalization. International Journal of Carbohydrate Chemistry. 2011, 1 (2011).
- Galdioli Pellá, M. C., et al. Chitosan hybrid microgels for oral drug delivery. Carbohydrate Polymers. 239, 116236 (2020).
- Echeverria, C., et al. One-pot synthesis of dual-stimuli responsive hybrid PNIPAAm-chitosan microgels. Materials & Design. 86, 745-751 (2015).
- Kim, M. Y., Kim, J. Chitosan microgels embedded with catalase nanozyme-loaded mesocellular silica foam for glucose-responsive drug delivery. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (4), 572-578 (2017).
- Mora-Boza, A., et al. Microfluidics generation of chitosan microgels containing glycerylphytate crosslinker for in situ human mesenchymal stem cells encapsulation. Materials Science and Engineering: C. 120, 111716 (2021).
- Zhang, H., Mardyani, S., Chan, W. C. W., Kumacheva, E. Design of biocompatible chitosan microgels for targeted pH-mediated intracellular release of cancer therapeutics. Biomacromolecules. 7 (5), 1568-1572 (2006).
- Huang, P., et al. Effect of pH on the mechanical, interfacial, and emulsification properties of chitosan microgels. Food Hydrocolloids. 121, 106972 (2021).
- Fletcher, N. A., Krebs, M. D. Sustained delivery of anti-VEGF from injectable hydrogel systems provides a prolonged decrease of endothelial cell proliferation and angiogenesis in vitro. RSC Advances. 8 (16), 8999-9005 (2018).
- Fletcher, N. A., Babcock, L. R., Murray, E. A., Krebs, M. D. Controlled delivery of antibodies from injectable hydrogels. Materials Science and Engineering: C. 59, 801-806 (2016).
- Fletcher, N. A., Von Nieda, E. L., Krebs, M. D. Cell-interactive alginate-chitosan biopolymer systems with tunable mechanics and antibody release rates. Carbohydrate Polymers. 175, 765-772 (2017).
- Erickson, C. B., et al. In vivo degradation rate of alginate-chitosan hydrogels influences tissue repair following physeal injury. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. , 34580 (2020).
- Erickson, C. B., et al. Anti-VEGF antibody delivered locally reduces bony bar formation following physeal injury in rats. Journal of Orthopaedic Research. , 24907 (2020).
- Lee, M. A., Nissen, T. P., Otsuka, N. Y. Utilization of a murine model to investigate the molecular process of transphyseal bone formation. Journal of Pediatric Orthopaedics. 20 (6), 802-806 (2000).
- Planka, L., et al. Nanotechnology and mesenchymal stem cells with chondrocytes in prevention of partial growth plate arrest in pigs. Biomedical Papers. 156 (2), 128-134 (2012).
- Yu, Y., et al. Rabbit model of physeal injury for the evaluation of regenerative medicine approaches. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (12), 701-710 (2019).
- Xian, C. J., Zhou, F. H., McCarty, R. C., Foster, B. K. Intramembranous ossification mechanism for bone bridge formation at the growth plate cartilage injury site. Journal of Orthopaedic Research. 22 (2), 417-426 (2004).
- Erickson, C. B., Shaw, N., Hadley-Miller, N., Riederer, M. S., Krebs, M. D., Payne, K. A. A rat tibial growth plate injury model to characterize repair mechanisms and evaluate growth plate regeneration strategies. Journal of Visualized Experiments. (125), e55571 (2017).
- Erickson, C., Stager, M., Riederer, M., Payne, K. A., Krebs, M. Emulsion-free chitosan-genipin microgels for growth plate cartilage regeneration. Journal of Biomaterials Applications. 36 (2), 289-296 (2021).
- Yang, D., et al. Microfluidic synthesis of chitosan-coated magnetic alginate microparticles for controlled and sustained drug delivery. International Journal of Biological Macromolecules. 182, 639-647 (2021).
- Marsili, L., Dal Bo, M., Berti, F., Toffoli, G. Thermoresponsive chitosan-grafted-poly(N-vinylcaprolactam) microgels via ionotropic gelation for oncological applications. Pharmaceutics. 13 (10), 1654 (2021).
- Muzzarelli, R., El Mehtedi, M., Bottegoni, C., Aquili, A., Gigante, A. Genipin-crosslinked chitosan gels and scaffolds for tissue engineering and regeneration of cartilage and bone. Marine Drugs. 13 (12), 7314-7338 (2015).
- Muzzarelli, R. A. A. Genipin-crosslinked chitosan hydrogels as biomedical and pharmaceutical aids. Carbohydrate Polymers. 77 (1), 1-9 (2009).
- Butler, M. F., Ng, Y. -. F., Pudney, P. D. A. Mechanism and kinetics of the crosslinking reaction between biopolymers containing primary amine groups and genipin. Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry. 41 (24), 3941-3953 (2003).
- Marquez-Curtis, L. A., Janowska-Wieczorek, A. Enhancing the migration ability of mesenchymal stromal cells by targeting the SDF-1/CXCR4 axis. BioMed Research International. 2013, 1-15 (2013).
- Tang, Q. O., et al. TGF-β3: A potential biological therapy for enhancing chondrogenesis. Expert Opinion on Biological Therapy. 9 (6), 689-701 (2009).
- Hogg, R., Turek, M. L., Kaya, E. The role of particle shape in size analysis and the evaluation of comminution processes. Particulate Science and Technology. 22 (4), 355-366 (2004).
- Raval, N., Maheshwari, R., Kalyane, D., Youngren-Ortiz, S. R., Chougule, M. B., Tekade, R. K. Importance of physicochemical characterization of nanoparticles in pharmaceutical product development. Basic Fundamentals of Drug Delivery. , 369-400 (2019).
