Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos
Summary
El presente protocolo describe un método no basado en emulsiones para la fabricación de microgeles de quitosano-genipina. El tamaño de estos microgeles se puede controlar con precisión, y pueden mostrar hinchazón dependiente del pH, degradarse in vivo y cargarse con moléculas terapéuticas que se liberan con el tiempo de manera sostenida, lo que las hace altamente relevantes para aplicaciones de ingeniería de tejidos.
Abstract
Los microgeles de quitosano son de gran interés en la ingeniería de tejidos debido a su amplia gama de aplicaciones, bajo costo e inmunogenicidad. Sin embargo, los microgeles de quitosano se fabrican comúnmente utilizando métodos de emulsión que requieren enjuagues con solventes orgánicos, que son tóxicos y dañinos para el medio ambiente. El presente protocolo presenta un método rápido, no citotóxico y no basado en emulsiones para fabricar microgeles de quitosano-genipina sin la necesidad de enjuagues con disolventes orgánicos. Los microgeles descritos aquí se pueden fabricar con un control de tamaño preciso. Exhiben una liberación sostenida de biomoléculas, lo que las hace altamente relevantes para la ingeniería de tejidos, biomateriales y medicina regenerativa. El quitosano se reticula con la genipina para formar una red de hidrogel, luego se pasa a través de un filtro de jeringa para producir los microgeles. Los microgeles se pueden filtrar para crear una variedad de tamaños, y muestran hinchazón dependiente del pH y se degradan con el tiempo enzimáticamente. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión de la placa de crecimiento de ratas y se demostró que promueven una mayor reparación del tejido del cartílago y muestran una degradación completa a los 28 días in vivo. Debido a su bajo costo, alta conveniencia y facilidad de fabricación con materiales citocompatibles, estos microgeles de quitosano presentan una tecnología emocionante y única en ingeniería de tejidos.
Introduction
La placa de crecimiento, también conocida como physis, es la estructura del cartílago ubicada al final de los huesos largos que media el crecimiento en los niños. Si la placa de crecimiento se lesiona, se puede formar tejido de reparación conocido como “barra ósea”, que interrumpe el crecimiento normal y puede causar defectos de crecimiento o deformidades angulares. Los datos epidemiológicos han demostrado que entre el 15% y el 30% de todas las lesiones esqueléticas infantiles están relacionadas con la placa de crecimiento. La formación de barras óseas ocurre en hasta el 30% de estas lesiones, lo que hace que las lesiones de la placa de crecimiento y su tratamiento asociado sean un problema de manifestación clínica significativa 1,2,3,4. Cuando se produce la formación de barras óseas, la vía de tratamiento más común consiste en reseccionar la barra ósea e insertar un material interposicional, como silicio o tejido adiposo5. Sin embargo, los pacientes que se someten a cirugía de resección de barra ósea a menudo tienen un mal pronóstico para la recuperación completa, ya que actualmente no existe un tratamiento que pueda reparar completamente una placa de crecimiento lesionada 6,7,8. A la luz de estas deficiencias, existe una necesidad crítica de estrategias efectivas para tratar las lesiones de la placa de crecimiento, tanto para prevenir la formación de una barra ósea como para regenerar el tejido sano del cartílago físico.
Las micropartículas de hidrogel, o microgeles, han ganado interés recientemente como andamios inyectables que pueden proporcionar una liberación sostenida de terapias9. Debido a su alta capacidad de adaptación y biocompatibilidad, los microgeles también son adecuados para el factor bioactivo o la encapsulación celular. Los microgeles pueden estar hechos de diversos materiales, que van desde polímeros sintéticos, como el polietilenglicol (PEG), hasta polímeros naturales como el alginato o el quitosano 10,11,12. Se ha demostrado que el quitosano tiene varios efectos beneficiosos para la ingeniería de tejidos, como su capacidad para desestabilizar la membrana externa de las bacterias gramnegativas, ofreciendo así una actividad antimicrobiana inherente1 3,14. Además, el quitosano es rentable, interactivo con las células y se modifica fácilmente utilizando su estructura que contiene aminas. Los microgeles a base de quitosano prometen una estrategia de biomaterial para la administración de fármacos y la señalización de materiales que pueden promover la regeneración de tejidos al tiempo que previenen la infección bacteriana. Sin embargo, los microgeles de quitosano a menudo se fabrican con una amplia gama de técnicas que requieren equipos especiales, técnicas de emulsión o enjuagues con solventes citotóxicos. Por ejemplo, algunos estudios han fabricado microgeles de quitosano con métodos basados en emulsiones, pero estos protocolos requieren enjuagues con disolventes y reticulantes citotóxicos, lo que podría negar su traducción a entornos clínicos15,16. Otros estudios han utilizado enfoques de microfluídica o electropulverización para fabricar microgeles de quitosano, que requieren equipo especial, preparación y capacitación17,18. Los microgeles de quitosano también se hacen comúnmente con un proceso de reticulación en solución de quitosano; sin embargo, este método depende en gran medida de la viscosidad de la solución, la concentración del polímero y el caudal, lo que dificulta el control del tamaño y la dispersión de los microgeles19,20. Por el contrario, el método para la fabricación de microgeles descrito en este documento no requiere equipos especializados ni enjuagues con solventes, lo que hace que estos microgeles sean viables para la fabricación en casi cualquier laboratorio o entorno. Por lo tanto, estos microgeles representan biomateriales altamente relevantes para un vehículo de administración de medicamentos rápido, rentable y fácil de producir para muchas aplicaciones.
Al modular la composición de un microgel y las características del material, los investigadores pueden obtener un control preciso sobre el microambiente celular, dirigiendo así el comportamiento celular de una manera dependiente del material. Los microgeles pueden emplearse solos o combinarse con sistemas de biomateriales a granel para impartir funcionalidades específicas, como la liberación prolongada de factores bioactivos o la señalización especial precisa para células nativas o exógenas. Los biomateriales y los microgeles han surgido como vías de tratamiento atractivas para las lesiones de las placas de crecimiento. Se ha dedicado un esfuerzo significativo al desarrollo de biomateriales a base de alginato y quitosano para tratar las lesiones de la placa de crecimiento 21,22,23,24,25. Debido a la naturaleza temporal dinámica de la osificación de la placa de crecimiento y el alargamiento óseo, el mecanismo de formación de barras óseas no se entiende completamente. Por lo tanto, se han desarrollado varios modelos animales para dilucidar mejor los mecanismos de osificación endocondral y formación de barras óseas, como en ratas, conejos y ovejas 26,27,28. Uno de estos modelos es un modelo de lesión de placa de crecimiento de rata, que utiliza un defecto de perforación en la tibia de la rata para producir una barra ósea de una manera predecible y reproducible e imita las lesiones humanas en las tres zonas de la placa de crecimiento29,30. Varias estrategias basadas en biomateriales para tratar las lesiones de la placa de crecimiento se han probado utilizando este modelo. Además, se han desarrollado dos métodos diferentes para fabricar microgeles de quitosano, que pueden ser utilizados como un sistema de biomaterial inyectable que libera terapias de manera sostenida10,31. Estos microgeles se han empleado en un modelo de lesión física de rata, y mostraron una mejor regeneración del cartílago31 al liberar SDF-1a y TGF-b3. Las técnicas proporcionadas en este protocolo describen los métodos desarrollados para fabricar estos microgeles de quitosano, que luego se pueden emplear en una amplia variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos. Por ejemplo, estudios recientes han utilizado microgeles de quitosano termo o magentos sensibles para aplicaciones de administración de fármacos oncológicos controlados32,33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los microgeles han sido ampliamente investigados en los últimos años debido a su alto nivel de aplicabilidad para diversos fines, como la administración de fármacos o la encapsulación celular9. La facilidad de fabricación de construcciones de biomateriales a microescala es de gran relevancia en la ingeniería de tejidos, ya que permite a los investigadores desarrollar estrategias basadas en hidrogel en un tamaño y escala de tiempo específicos. Sin embargo, la mayoría de los métodos para …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Artritis y Enfermedades Musculoesqueléticas y de la Piel del Instituto Nacional de Salud bajo los números de premio R03AR068087 y R21AR071585 y por la Fundación Boettcher (# 11219) a MDK. CBE fue apoyado por NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081.
Materials
| Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
| BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
| Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
| Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
| Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
| Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
| Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
| Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
| Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
| Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
| Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
| Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
| Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |
Riferimenti
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