Das vorliegende Protokoll beschreibt ein nicht-emulsionsbasiertes Verfahren zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen. Die Größe dieser Mikrogele kann präzise kontrolliert werden, und sie können pH-abhängige Schwellungen aufweisen, in vivo abgebaut werden und mit therapeutischen Molekülen beladen sein, die im Laufe der Zeit nachhaltig freigesetzt werden, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen sehr relevant macht.
Chitosan-Mikrogele sind aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums, ihrer niedrigen Kosten und ihrer Immunogenität von großem Interesse im Tissue Engineering. Chitosan-Mikrogele werden jedoch üblicherweise mit Emulsionsmethoden hergestellt, die organische Lösungsmittelspülungen erfordern, die giftig und umweltschädlich sind. Das vorliegende Protokoll stellt eine schnelle, nicht zytotoxische, nicht auf Emulsion basierende Methode zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen ohne die Notwendigkeit organischer Lösungsmittelspülungen vor. Die hierin beschriebenen Mikrogele können mit präziser Größenkontrolle hergestellt werden. Sie weisen eine anhaltende Freisetzung von Biomolekülen auf und sind damit für Tissue Engineering, Biomaterialien und regenerative Medizin von hoher Relevanz. Chitosan wird mit Genipin zu einem Hydrogelnetzwerk vernetzt und dann durch einen Spritzenfilter geleitet, um die Mikrogele herzustellen. Die Mikrogele können gefiltert werden, um eine Reihe von Größen zu erzeugen, und sie zeigen pH-abhängige Schwellungen und bauen sich im Laufe der Zeit enzymatisch ab. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell eingesetzt und es wurde gezeigt, dass sie eine erhöhte Knorpelgewebereparatur fördern und nach 28 Tagen in vivo einen vollständigen Abbau zeigen. Aufgrund ihrer niedrigen Kosten, ihres hohen Komforts und ihrer einfachen Herstellung mit zytokompatiblen Materialien stellen diese Chitosan-Mikrogele eine aufregende und einzigartige Technologie im Tissue Engineering dar.
Die Wachstumsplatte, auch bekannt als Physis, ist die Knorpelstruktur am Ende langer Knochen, die das Wachstum bei Kindern vermittelt. Wenn die Wachstumsplatte verletzt wird, kann sich Reparaturgewebe bilden, das als “knöcherner Balken” bekannt ist, was das normale Wachstum unterbricht und Wachstumsdefekte oder Winkeldeformitäten verursachen kann. Epidemiologische Daten haben gezeigt, dass 15%-30% aller Skelettverletzungen im Kindesalter mit der Wachstumsplatte zusammenhängen. Die Bildung von Knochenstäben tritt bei bis zu 30% dieser Verletzungen auf, was Wachstumsplattenverletzungen und die damit verbundene Behandlung zu einem signifikanten klinischen Manifestationsproblemmacht 1,2,3,4. Wenn eine knöcherne Stabbildung auftritt, besteht der häufigste Behandlungsweg darin, den knöchernen Stab zu resektieren und ein Interpositionsmaterial wie Silizium oder Fettgewebeeinzuführen 5. Patienten, die sich einer knöchernen Bar-Resektionsoperation unterziehen, haben jedoch oft eine schlechte Prognose für eine vollständige Genesung, da es derzeit keine Behandlung gibt, die eine verletzte Wachstumsplatte vollständig reparieren kann 6,7,8. Angesichts dieser Mängel besteht ein kritischer Bedarf an wirksamen Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen, sowohl bei der Verhinderung der Bildung eines knöchernen Balkens als auch bei der Regeneration von gesundem physärem Knorpelgewebe.
Hydrogel-Mikropartikel oder Mikrogele haben in letzter Zeit Interesse als injizierbare Gerüste gewonnen, die eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika ermöglichenkönnen 9. Aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit und Biokompatibilität eignen sich Mikrogele auch gut für die Bioaktivfaktor- oder Zellverkapselung. Mikrogele können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, die von synthetischen Polymeren wie Polyethylenglykol (PEG) bis hin zu natürlichen Polymeren wie Alginat oder Chitosan10,11,12 reichen. Es hat sich gezeigt, dass Chitosan mehrere positive Auswirkungen auf das Tissue Engineering hat, wie z.B. seine Fähigkeit, die äußere Membran von gramnegativen Bakterien zu destabilisieren und dadurch inhärente antimikrobielle Aktivitätzu bieten 1 3,14. Darüber hinaus ist Chitosan kostengünstig, zellinteraktiv und leicht zu modifizieren mit seiner aminhaltigen Struktur. Chitosan-basierte Mikrogele versprechen eine Biomaterialstrategie für die Arzneimittelabgabe und Materialsignalisierung, die die Geweberegeneration fördern und gleichzeitig bakterielle Infektionen verhindern kann. Chitosan-Mikrogele werden jedoch oft mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, die spezielle Ausrüstung, Emulsionstechniken oder zytotoxische Lösungsmittelspülungen erfordern. Zum Beispiel haben einige Studien Chitosan-Mikrogele mit emulsionsbasierten Methoden hergestellt, aber diese Protokolle erfordern Lösungsmittelspülungen und zytotoxische Vernetzer, was möglicherweise ihre Translation in klinische Umgebungen negiert15,16. Andere Studien haben Mikrofluidik- oder Elektrospray-Ansätze verwendet, um Chitosan-Mikrogele herzustellen, die spezielle Ausrüstung, Vorbereitung und Schulung erfordern17,18. Chitosan-Mikrogele werden auch üblicherweise mit einem tropfenweisen Prozess des Vernetzers in Chitosanlösung hergestellt; Diese Methode ist jedoch stark von der Lösungsviskosität, der Polymerkonzentration und der Durchflussrate abhängig, was es schwierig macht, die Größe und Dispersität der Mikrogele19,20 zu kontrollieren. Umgekehrt erfordert das hierin beschriebene Verfahren zur Mikrogelherstellung keine spezielle Ausrüstung oder Lösungsmittelspülungen, wodurch diese Mikrogele für die Herstellung in fast jedem Labor oder jeder Umgebung geeignet sind. Daher stellen diese Mikrogele hochrelevante Biomaterialien für ein schnelles, kostengünstiges und einfach herzustellendes Arzneimittelabgabevehikel für viele Anwendungen dar.
Durch die Modulation der Zusammensetzung und der Materialeigenschaften eines Mikrogels können Forscher eine präzise Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung erlangen und so das Zellverhalten materialabhängig steuern. Mikrogele können allein oder in Kombination mit Bulk-Biomaterialsystemen eingesetzt werden, um spezifische Funktionalitäten zu vermitteln, wie z.B. die verlängerte Freisetzung bioaktiver Faktoren oder eine präzise spezielle Signalgebung für native oder exogene Zellen. Biomaterialien und Mikrogele haben sich als attraktive Behandlungsmöglichkeiten für Wachstumsplattenverletzungen herauskristallisiert. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Alginat- und Chitosan-basierte Biomaterialien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen zu entwickeln 21,22,23,24,25. Aufgrund der dynamischen zeitlichen Natur der Wachstumsplattenverknöcherung und Knochendehnung ist der Mechanismus der knöchernen Balkenbildung nicht vollständig verstanden. Daher wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um die Mechanismen der endochondralen Ossifikation und der knöchernen Balkenbildung, wie bei Ratten, Kaninchen und Schafen, besser aufzuklären26,27,28. Ein solches Modell ist ein Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell, das einen Bohrlochdefekt in der Rattentibia verwendet, um einen knöchernen Balken in einer vorhersehbaren und reproduzierbaren Weise herzustellen und menschliche Verletzungen in allen drei Zonen der Wachstumsplatte 29,30 nachzuahmen. Mehrere biomaterialbasierte Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen wurden mit diesem Modell getestet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen entwickelt, die als injizierbares Biomaterialsystem verwendet werden können, das Therapeutika nachhaltig freisetzt 10,31. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenphyseal-Verletzungsmodell eingesetzt und zeigten eine verbesserte Knorpelregeneration31 bei der Freisetzung von SDF-1a und TGF-b3. Die in diesem Protokoll bereitgestellten Techniken beschreiben Methoden, die zur Herstellung dieser Chitosan-Mikrogele entwickelt wurden, die dann in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt werden können. Zum Beispiel haben neuere Studien thermo- oder magento-responsive Chitosan-Mikrogele für kontrollierte onkologische Arzneimittelverabreichungsanwendungenverwendet 32,33.
Mikrogele wurden in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Anwendbarkeit für verschiedene Zwecke, wie z.B. Arzneimittelabgabe oder Zellverkapselung, umfassend erforscht9. Die einfache Herstellung von Biomaterialkonstrukten im Mikromaßstab ist im Tissue Engineering von erheblicher Bedeutung, da sie es Forschern ermöglicht, Hydrogel-basierte Strategien in einer bestimmten Größe und Zeitskala zu entwickeln. Die meisten Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen erfordern jedoch teure Ger?…
The authors have nothing to disclose.
Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases des National Institute of Health unter den Preisnummern R03AR068087 und R21AR071585 und von der Boettcher Foundation (#11219) an MDK unterstützt. CBE wurde von NIH/NCATS Colorado CTSA Grant Number TL1 TR001081 unterstützt.
Acetic acid | SigmaAldrich | AX0073 | |
BD Luer-Lock Syringe | Fisher Scientific | 14-823-16E | |
Büchner Funnel | Fisher Scientific | FB966F | 100 mm diameter |
Chitosan (low molecular weight) | SigmaAldrich | 448869 | 75-80% deacetylation |
Dialysis Membrane Tubing | Fisher Scientific | 08-670-5C | 3500 MWCO |
Ethanol | SigmaAldrich | 493538 | |
Genipin | SigmaAldrich | G4796 | |
Heracell 150i Incubator | ThermoFisher | 50116047 | |
Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
Recombinant human SDF-1a | Peprotech | 300-28A | |
Recombinant human TGF-b3 | Peprotech | 100-36E | |
Whatman Filter Paper Grade 540 | SigmaAldrich | Z241547 | 8 mm pore size |
Whatman Filter Paper Grade 541 | SigmaAldrich | WHA1541055 | 22 mm pore size |
Whatman Filter paper Grade 542 | SigmaAldrich | WHA1542185 | 2.7 mm pore size |
Wire Mesh Sieve | McMaster-Carr | 9317T86 | No. 100 Mesh |