Herstellung von größenkontrollierten und emulsionsfreien Chitosan-Genipin-Mikrogelen für Tissue-Engineering-Anwendungen

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein nicht-emulsionsbasiertes Verfahren zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen. Die Größe dieser Mikrogele kann präzise kontrolliert werden, und sie können pH-abhängige Schwellungen aufweisen, in vivo abgebaut werden und mit therapeutischen Molekülen beladen sein, die im Laufe der Zeit nachhaltig freigesetzt werden, was sie für Tissue-Engineering-Anwendungen sehr relevant macht.

Abstract

Chitosan-Mikrogele sind aufgrund ihres breiten Anwendungsspektrums, ihrer niedrigen Kosten und ihrer Immunogenität von großem Interesse im Tissue Engineering. Chitosan-Mikrogele werden jedoch üblicherweise mit Emulsionsmethoden hergestellt, die organische Lösungsmittelspülungen erfordern, die giftig und umweltschädlich sind. Das vorliegende Protokoll stellt eine schnelle, nicht zytotoxische, nicht auf Emulsion basierende Methode zur Herstellung von Chitosan-Genipin-Mikrogelen ohne die Notwendigkeit organischer Lösungsmittelspülungen vor. Die hierin beschriebenen Mikrogele können mit präziser Größenkontrolle hergestellt werden. Sie weisen eine anhaltende Freisetzung von Biomolekülen auf und sind damit für Tissue Engineering, Biomaterialien und regenerative Medizin von hoher Relevanz. Chitosan wird mit Genipin zu einem Hydrogelnetzwerk vernetzt und dann durch einen Spritzenfilter geleitet, um die Mikrogele herzustellen. Die Mikrogele können gefiltert werden, um eine Reihe von Größen zu erzeugen, und sie zeigen pH-abhängige Schwellungen und bauen sich im Laufe der Zeit enzymatisch ab. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell eingesetzt und es wurde gezeigt, dass sie eine erhöhte Knorpelgewebereparatur fördern und nach 28 Tagen in vivo einen vollständigen Abbau zeigen. Aufgrund ihrer niedrigen Kosten, ihres hohen Komforts und ihrer einfachen Herstellung mit zytokompatiblen Materialien stellen diese Chitosan-Mikrogele eine aufregende und einzigartige Technologie im Tissue Engineering dar.

Introduction

Die Wachstumsplatte, auch bekannt als Physis, ist die Knorpelstruktur am Ende langer Knochen, die das Wachstum bei Kindern vermittelt. Wenn die Wachstumsplatte verletzt wird, kann sich Reparaturgewebe bilden, das als “knöcherner Balken” bekannt ist, was das normale Wachstum unterbricht und Wachstumsdefekte oder Winkeldeformitäten verursachen kann. Epidemiologische Daten haben gezeigt, dass 15%-30% aller Skelettverletzungen im Kindesalter mit der Wachstumsplatte zusammenhängen. Die Bildung von Knochenstäben tritt bei bis zu 30% dieser Verletzungen auf, was Wachstumsplattenverletzungen und die damit verbundene Behandlung zu einem signifikanten klinischen Manifestationsproblem^macht 1,2,3,4. Wenn eine knöcherne Stabbildung auftritt, besteht der häufigste Behandlungsweg darin, den knöchernen Stab zu resektieren und ein Interpositionsmaterial wie Silizium oder Fettgewebe^{einzuführen 5}. Patienten, die sich einer knöchernen Bar-Resektionsoperation unterziehen, haben jedoch oft eine schlechte Prognose für eine vollständige Genesung, da es derzeit keine Behandlung gibt, die eine verletzte Wachstumsplatte vollständig reparieren kann ^6,7,8. Angesichts dieser Mängel besteht ein kritischer Bedarf an wirksamen Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen, sowohl bei der Verhinderung der Bildung eines knöchernen Balkens als auch bei der Regeneration von gesundem physärem Knorpelgewebe.

Hydrogel-Mikropartikel oder Mikrogele haben in letzter Zeit Interesse als injizierbare Gerüste gewonnen, die eine anhaltende Freisetzung von Therapeutika ermöglichen^{können 9}. Aufgrund ihrer hohen Abstimmbarkeit und Biokompatibilität eignen sich Mikrogele auch gut für die Bioaktivfaktor- oder Zellverkapselung. Mikrogele können aus verschiedenen Materialien hergestellt werden, die von synthetischen Polymeren wie Polyethylenglykol (PEG) bis hin zu natürlichen Polymeren wie Alginat oder Chitosan^10,11,12 reichen. Es hat sich gezeigt, dass Chitosan mehrere positive Auswirkungen auf das Tissue Engineering hat, wie z.B. seine Fähigkeit, die äußere Membran von gramnegativen Bakterien zu destabilisieren und dadurch inhärente antimikrobielle Aktivität^{zu bieten 1 3,14}. Darüber hinaus ist Chitosan kostengünstig, zellinteraktiv und leicht zu modifizieren mit seiner aminhaltigen Struktur. Chitosan-basierte Mikrogele versprechen eine Biomaterialstrategie für die Arzneimittelabgabe und Materialsignalisierung, die die Geweberegeneration fördern und gleichzeitig bakterielle Infektionen verhindern kann. Chitosan-Mikrogele werden jedoch oft mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, die spezielle Ausrüstung, Emulsionstechniken oder zytotoxische Lösungsmittelspülungen erfordern. Zum Beispiel haben einige Studien Chitosan-Mikrogele mit emulsionsbasierten Methoden hergestellt, aber diese Protokolle erfordern Lösungsmittelspülungen und zytotoxische Vernetzer, was möglicherweise ihre Translation in klinische Umgebungen negiert^15,16. Andere Studien haben Mikrofluidik- oder Elektrospray-Ansätze verwendet, um Chitosan-Mikrogele herzustellen, die spezielle Ausrüstung, Vorbereitung und Schulung erfordern^17,18. Chitosan-Mikrogele werden auch üblicherweise mit einem tropfenweisen Prozess des Vernetzers in Chitosanlösung hergestellt; Diese Methode ist jedoch stark von der Lösungsviskosität, der Polymerkonzentration und der Durchflussrate abhängig, was es schwierig macht, die Größe und Dispersität der Mikrogele^19,20 zu kontrollieren. Umgekehrt erfordert das hierin beschriebene Verfahren zur Mikrogelherstellung keine spezielle Ausrüstung oder Lösungsmittelspülungen, wodurch diese Mikrogele für die Herstellung in fast jedem Labor oder jeder Umgebung geeignet sind. Daher stellen diese Mikrogele hochrelevante Biomaterialien für ein schnelles, kostengünstiges und einfach herzustellendes Arzneimittelabgabevehikel für viele Anwendungen dar.

Durch die Modulation der Zusammensetzung und der Materialeigenschaften eines Mikrogels können Forscher eine präzise Kontrolle über die zelluläre Mikroumgebung erlangen und so das Zellverhalten materialabhängig steuern. Mikrogele können allein oder in Kombination mit Bulk-Biomaterialsystemen eingesetzt werden, um spezifische Funktionalitäten zu vermitteln, wie z.B. die verlängerte Freisetzung bioaktiver Faktoren oder eine präzise spezielle Signalgebung für native oder exogene Zellen. Biomaterialien und Mikrogele haben sich als attraktive Behandlungsmöglichkeiten für Wachstumsplattenverletzungen herauskristallisiert. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Alginat- und Chitosan-basierte Biomaterialien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen zu entwickeln 21,22,23,24,25. Aufgrund der dynamischen zeitlichen Natur der Wachstumsplattenverknöcherung und Knochendehnung ist der Mechanismus der knöchernen Balkenbildung nicht vollständig verstanden. Daher wurden mehrere Tiermodelle entwickelt, um die Mechanismen der endochondralen Ossifikation und der knöchernen Balkenbildung, wie bei Ratten, Kaninchen und Schafen, besser aufzuklären^26,27,28. Ein solches Modell ist ein Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell, das einen Bohrlochdefekt in der Rattentibia verwendet, um einen knöchernen Balken in einer vorhersehbaren und reproduzierbaren Weise herzustellen und menschliche Verletzungen in allen drei Zonen der Wachstumsplatte ^29,30 nachzuahmen. Mehrere biomaterialbasierte Strategien zur Behandlung von Wachstumsplattenverletzungen wurden mit diesem Modell getestet. Darüber hinaus wurden zwei verschiedene Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen entwickelt, die als injizierbares Biomaterialsystem verwendet werden können, das Therapeutika nachhaltig freisetzt ^10,31. Diese Mikrogele wurden in einem Rattenphyseal-Verletzungsmodell eingesetzt und zeigten eine verbesserte Knorpelregeneration³¹ bei der Freisetzung von SDF-1a und TGF-b3. Die in diesem Protokoll bereitgestellten Techniken beschreiben Methoden, die zur Herstellung dieser Chitosan-Mikrogele entwickelt wurden, die dann in einer Vielzahl von Tissue-Engineering-Anwendungen eingesetzt werden können. Zum Beispiel haben neuere Studien thermo- oder magento-responsive Chitosan-Mikrogele für kontrollierte onkologische Arzneimittelverabreichungsanwendungen^{verwendet 32,33}.

Protocol

Alle Tierverfahren wurden vom University of Colorado Denver Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. 6 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden für die vorliegende Studie verwendet. Das Rattenwachstumsplattenverletzungsmodell wurde nach einem zuvor veröffentlichten Berichterstellt 30. 1. Herstellung des Chitosanpolymers Erhalten Sie gereinigtes und lyophilisiertes niedermolekulares (LMW) Chitosan aus kommerziell verf…

Representative Results

Die erfolgreiche Herstellung von Chitosan-Mikrogelen beruht auf der Vernetzungsreaktion zwischen Genipin und Chitosan, an der insbesondere die Amine an den Chitosan-Polymerketten beteiligt sind. Im Gegensatz zu anderen Mikrogel-Herstellungstechniken erfordert diese Methode keine Emulsionen oder Lösungsmittelspülungen und kann schnell und einfach mit kostengünstigen Geräten durchgeführt werden. Ein charakteristischer Indikator für eine erfolgreiche Mikrogelherstellung ist der deutliche Farbwechsel von cremefarben zu…

Discussion

Mikrogele wurden in den letzten Jahren aufgrund ihrer hohen Anwendbarkeit für verschiedene Zwecke, wie z.B. Arzneimittelabgabe oder Zellverkapselung, umfassend erforscht⁹. Die einfache Herstellung von Biomaterialkonstrukten im Mikromaßstab ist im Tissue Engineering von erheblicher Bedeutung, da sie es Forschern ermöglicht, Hydrogel-basierte Strategien in einer bestimmten Größe und Zeitskala zu entwickeln. Die meisten Methoden zur Herstellung von Chitosan-Mikrogelen erfordern jedoch teure Ger?…

Materials

Acetic acid	SigmaAldrich	AX0073
BD Luer-Lock Syringe	Fisher Scientific	14-823-16E
Büchner Funnel	Fisher Scientific	FB966F	100 mm diameter
Chitosan (low molecular weight)	SigmaAldrich	448869	75-80% deacetylation
Dialysis Membrane Tubing	Fisher Scientific	08-670-5C	3500 MWCO
Ethanol	SigmaAldrich	493538
Genipin	SigmaAldrich	G4796
Heracell 150i Incubator	ThermoFisher	50116047
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12
Recombinant human SDF-1a	Peprotech	300-28A
Recombinant human TGF-b3	Peprotech	100-36E
Whatman Filter Paper Grade 540	SigmaAldrich	Z241547	8 mm pore size
Whatman Filter Paper Grade 541	SigmaAldrich	WHA1541055	22 mm pore size
Whatman Filter paper Grade 542	SigmaAldrich	WHA1542185	2.7 mm pore size
Wire Mesh Sieve	McMaster-Carr	9317T86	No. 100 Mesh