Isolamento dei preadipociti dagli embrioni di pulcino di pollo

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo semplice per isolare i preadipociti dal tessuto adiposo negli embrioni di polli da carne. Questo metodo consente l'isolamento con alta resa, coltura primaria e differenziazione adipogenica dei preadipociti. La colorazione Oil Red O e la colorazione lipidico/DNA hanno misurato la capacità adipogenica delle cellule isolate indotte con mezzi di differenziazione.

Abstract

I preadipociti primari sono un prezioso sistema sperimentale per comprendere le vie molecolari che controllano la differenziazione e il metabolismo degli adipociti. Gli embrioni di pollo offrono l'opportunità di isolare i preadipociti fin dalla prima fase dello sviluppo adiposo. Questa cellula primaria può essere utilizzata per identificare i fattori che influenzano la proliferazione dei preadipociti e la differenziazione adipogenica, rendendoli un modello prezioso per gli studi relativi all'obesità infantile e al controllo della deposizione di grasso in eccesso nel pollame. La rapida crescita del tessuto adiposo postnatale spreca efficacemente il mangime allocandolo lontano dalla crescita muscolare nei polli da carne. Pertanto, i metodi per comprendere le prime fasi dello sviluppo del tessuto adiposo possono fornire indizi per regolare questa tendenza e identificare modi per limitare l'espansione adiposa all'inizio della vita. Il presente studio è stato progettato per sviluppare un metodo efficiente per l'isolamento, la coltura primaria e la differenziazione adipogenica dei preadipociti isolati dallo sviluppo del tessuto adiposo di embrioni di pulcino di polli da carne commerciali (tipo carne). La procedura è stata ottimizzata per produrre cellule con elevata vitalità (~ 98%) e una maggiore capacità di differenziarsi in adipociti maturi. Questo semplice metodo di isolamento, coltura e differenziazione dei preadipociti embrionali supporta le analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso nei primi anni di vita.

Introduction

L'obesità è una minaccia per la salute globale sia per gli adulti che per i bambini. I bambini in sovrappeso o obesi hanno circa cinque volte più probabilità di essere obesi da adulti, ponendoli a un rischio significativamente maggiore di malattie cardiovascolari, diabete e molte altre comorbidità. Circa il 13,4% dei bambini statunitensi di età compresa tra 2 e 5 anni ha l'obesità¹, dimostrando che la tendenza ad accumulare grasso corporeo in eccesso può essere messa in moto molto presto nella vita. Per ragioni molto diverse, l'accumulo di tessuto adiposo in eccesso è una preoccupazione per i polli da carne (tipo carne). I polli da carne modern....

Protocol

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Tennessee. Le uova di pollo commerciali appena fecondate (Cobb 500) sono state ottenute da un incubatoio locale. Le uova sono state incubate a 38 °C con il 60% di umidità relativa fino alle dissezioni nei giorni embrionali 16-18 (E16-E18). Il tessuto adiposo è stato raccolto dal deposito sottocutaneo (femorale).

1. Preparazione all'isolamento e alla cultura

1. Preparare la cappa di cultura e gli strumenti.
   1. Prima di iniziare le dissezioni, impostare un'area di lavoro nella ca....

Results

I preadipociti primari sono morfologicamente simili ai fibroblasti, con forme irregolari simili a stelle e un nucleo centrale (Figura 2A-C). Le cellule aderiscono prontamente alla plastica di coltura tissutale e iniziano a proliferare subito dopo l'attaccamento. Differenziano e accumulano rapidamente goccioline lipidiche (Figura 3D) quando vengono fornite di acidi grassi nel mezzo. La vitalità (98%, basata sull'esclusione del co.......

Discussion

Sebbene diversi protocolli ben descritti abbiano riportato l'isolamento dei preadipociti 14,15,16,17, l'isolamento per i preadipociti embrionali è stato ottimizzato, che può essere utilizzato per analisi funzionali della crescita e dello sviluppo del grasso precoce nei pulcini da carne. Questo protocollo produce progenitori embrionali di adipociti ad alta vitalità con un elevato potenziale di d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetta da 1 mL	Eppendorf	Z683825	Pipetta monocanale, 100 - 1000 &; L
1 mL Puntale per pipetta	Fisher Scientific	02-707-402
100% isopropanolo	Fisher Scientific	A426P4
1x PBS	Gibco	10010023
25 mL Pallone	Pyrex	4980-25
37% Formaldeide	Fisher Scientific	F75P-1GAL
Piastra a 6 pozzetti	Falcon	353046	Piastra
saggi a 96 pozzetti	Costar	3632
Piastra a 96 pozzetti, fondo nero	Costar	3603	Adipo trattato con coltura tissutaleRed
	Lonza	PT-7009
Amfotericina B	Gibco	15290026
raschiatore da banco (Kimtechwiper)	Kimberly-Clark	34155
Betadine	Su & Up	NDC 1167300334	20% soluzione di lavoro
Contatore di celle	Corning	6749
Filtro cellulare, 40 &; micro; m	SPL	93040
Centrifugaton	Eppendorf	5702
Siero di pollo	Gibco	16110082
Provette da centrifuga coniche, 15 mL	VWR	10025-690
Provette da centrifuga conica, 50 mL	Falcon	352098
Cryovial	Nunc	343958
Pinze curve, 100 mm	Roboz Surgical	RS-5137
Forbici chirurgiche curve, 115 mm	Roboz Surgical	RS-6839
Acqua distillata	Millipore	SYNSV0000	erogato secondo necessità
DMEM/F12	HyClone	SH30023.01
DMSO	Sigma	D2650
Ethanol	Decon Labs	2701	70% soluzione di lavoro
Siero fetale bovino (FBS)	Microscopio fluorescente Gibco	10437028
	EVOS	M7000
Lettore di piastre fluorescenti	Biotek	Synergy H1
Foil	Reynolds		Reynolds Wrap Foglio di alluminio per impieghi gravosi, 125 SQ.
Contenitore di congelamento	Thermo Scientific	5100-0001
Gelatina	Millipore	4055	2% soluzione di lavoro
Ematocitometro (camera di conteggio)	Corning	480200	0,1 mm di profondità
Incubatore	Fisher Scientific	6845
Sterilizzatore per strumenti	VWR	B1205
Acido linoleico-oleico Acid-Albumin	Sigma	L9655	1x Soluzione
di lavoro Microscopio	Evos	AMEX1000
Pipetta multicanale	Thermo Scientific	4661070	Pipettatori a 12 canali, 30 - 300 &; L
Na2HPO4	Sigma	S-7907
NaH2PO4	Sigma	S-3139
NucBlue	Invitrogen	R37605
Oil Red O	Sigma	O-0625
Orbital Shaker	IKA	KS130BS1
Tovagliolo di carta	Tork	RK8002
Parafilm	Parafilm M	PM996
Penicillina/Steptomamicina (P/S)	Gibco	15140122	1x Piastre di Petri per soluzione di lavoro
Piastre di Petri Falcon	351029	100 mm
			da 60 mm
	VWR	200
RBC	Roche	11814389001
Reagent Reservior	VWR	89094-680
Bicchiere piccolo, 100 mL	Pyrex	1000-100
Spettrofotometro Lettore di piastre Biotek		Synergy H1
Garza sterile	McKesson	762703
Pinza dritta, 120 mm	Roboz Surgical	RS-4960
Forbici dritte, 140 mm	Roboz Surgical	RS-6762
T-25 Flask	Corning	430639	Incubatore per colture tissutali trattate con coltura tissutale
	Thermo Scientific 50144906
Filtro per tessuti, 250 &; m	Pierce	87791
Trypan Blue Stain	Gibco	15250061
Trypsin	Gibco	15400054	0,1% Pinzette per soluzione di lavoro
, 110 mm	Roboz Surgical	RS-5035
Tipo 1 Collagenase	Gibco	17100017
Bagno d'acqua	Fisher Scientific	15-462-10
Carta da filtro Whatman grado 1	Whatman	1001-110