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Biologia

実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導と多様な評価指標

Published: September 09, 2022
doi:
10.3791/63866
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1Putuo People’s Hospital, Shanghai Key Laboratory of Signaling and Disease Research, School of Life Sciences and Technology,Tongji University, 2National Laboratory of Biomacromolecules, CAS Center for Excellence in Biomacromolecules, Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 3Department of Infectious Diseases, Shanghai Key Laboratory of Infectious Diseases and Biosafety Emergency Response, National Medical Center for Infectious Diseases, Huashan Hospital,Fudan University

Summary

本プロトコルは、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質を使用し、臨床スコアリングシステムを使用して疾患プロセスをモニタリングするマウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘発を記載しています。実験的自己免疫性脳脊髄炎関連症状は、マウス大腿骨マイクロコンピューター断層撮影分析とオープンフィールドテストを使用して分析され、疾患プロセスを包括的に評価します。

Abstract

多発性硬化症(MS)は、炎症性浸潤、脱髄、および軸索損傷を特徴とする中枢神経系(CNS)の典型的な自己免疫疾患です。現在、MSを完全に治癒するための対策はありませんが、疾患の進行を制御および緩和するために、複数の疾患修飾療法(DMT)が利用可能です。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)とMS患者のCNS病理学的特徴の間には有意な類似点がある。EAEは、MS薬の有効性を判断し、MS疾患の新しい治療法の開発を探索するための代表的なモデルとして広く使用されています。マウスにおけるEAEの能動的誘導は、安定かつ再現性のある効果を有し、自己免疫性神経炎症に対する薬物または遺伝子の効果を研究するのに特に適している。C57BL/6Jマウスにミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質(MOG35-55)を免疫する方法と、臨床スコアリングシステムを用いた疾患症状の日々の評価が主に共有されています。多様な臨床症状を伴うMSの複雑な病因を考えると、既存の臨床スコアリングシステムは疾患治療の評価を満たすことができません。単一の介入の欠点を回避するために、MS患者の不安様気分および骨粗鬆症の臨床症状に基づいてEAEを評価するための新しい指標が作成され、MS治療のより包括的な評価が提供されます。

Introduction

自己免疫疾患は、それ自体の抗原に対する免疫系の免疫応答によって引き起こされる一連の障害であり、組織の損傷または機能障害を引き起こします1。多発性硬化症(MS)は、中枢神経系(CNS)における多発ニューロパチーの慢性自己免疫疾患であり、炎症性浸潤、脱髄、およびニューロン軸索変性を特徴とする2,3。現在、MSは世界中で250万人もの人々に影響を与えており、主に20〜40歳の若者と中年の人々であり、家族や社会のバックボーンであることがよくあります。これは、家族や社会に多大な影響と害をもたらしました2,4。

MSは、多様で複雑な臨床症状を伴う多因子性疾患です。炎症性浸潤および脱髄を特徴とする古典的な神経障害に加えて、MSはしばしば視覚障害、四肢ジスキネジア、および認知および感情障害を示します5,6,7。MS患者が適切で正しい治療を受けない場合、その半数は20年後に車椅子で生活し、半数近くが抑うつ症状や不安症状を経験し、一般集団よりもはるかに高いレベルの自殺念慮につながります8,9。

長い研究期間にもかかわらず、MSの病因はとらえどころのないままであり、MSの病因はまだ解明されていません。MSの動物モデルは、げっ歯類とヒトの免疫系の間に大きな違いがあるにもかかわらず、同時にいくつかの基本原則を共有しながら、疾患の発症と新しい治療アプローチを探求するためのテストツールとして機能することを可能にしました。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)は現在、MSを研究するための理想的な動物モデルであり、ミエリンタンパク質からの自己抗原免疫を使用して感受性マウスのCNS成分に対する自己免疫を誘導し、完全なフロイントアジュバント(CFA)と百日咳毒素(PTX)を加えて体液性免疫応答を強化します。遺伝的背景および免疫抗原に応じて、MS10、11、12の様々な臨床形態を模倣するために、急性、再発寛解、または慢性を含む異なる疾患プロセスが得られる。EAEモデルの構築に一般的に使用される関連する免疫原は、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、またはミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)などの自己CNSタンパク質に由来します。MBPまたはPLP免疫SJL/Lマウスは再発寛解型経過を発症し、MOGはC57BL/6マウスにおいて慢性進行性EAEを引き起こす11,12,13。

疾患修飾療法(DMT)の主な目的は、疾患の症状を最小限に抑え、機能を改善することです6。MSを緩和するために臨床的に使用されている薬剤はいくつかありますが、MSを完全に治癒するための薬剤はまだ使用されておらず、相乗的治療の必要性が明らかになりました。現在、トランスジェニックマウスの構築にはC57BL/6マウスが最も一般的に使用されており、この研究では、C57BL/6JマウスのMOG35-55 によって誘導されたEAEモデルを5点スケールで使用して、疾患の進行を監視しました。EAEモデルはまた、不安のような気分や骨量減少、および広く知られている脱髄病変に苦しんでいます。ここでは、オープンフィールドテストとマイクロコンピュータ断層撮影(マイクロCT)分析を用いてEAEの症状を多角的に評価する方法についても説明します。

Protocol

同済大学の動物管理委員会は現在の作業を承認し、すべての動物飼育ガイドラインに従いました。8〜12週齢の雄または雌のC57BL / 6Jマウスを実験に使用しました。実験群では年齢と性別が同じであることが確認された。そうでなければ、病気に対する感受性が影響を受けました。マウスを、一定の条件(室温23±1°C、湿度50%±10%)で12時間の明暗サイクルを交互に行い、マウスの餌と水を自由に利?…

Representative Results

マウスの免疫後、マウスの体重が毎日記録され、それらの臨床症状が上記のプロトコルに従って評価される(ステップ4)。MOGペプチドを免疫したC57BL/6Jマウスでは、病変部位が主に脊髄に限定されるため、EAEマウスの病因は尾端から頭部に広がります。疾患の開始時に、EAEマウスは尾の脱力感および垂れ下がりを示し、続いて後肢の脱力感、協調性のない動き、および麻痺を示す。病気が悪化?…

Discussion

MSはCNSの脱髄炎症性疾患であり、若者に慢性障害を引き起こす最も一般的な神経障害の1つであり、家族や社会に大きな負担をかけています3,4。MSは常に臓器特異的T細胞媒介性自己免疫疾患として分類されており、自己免疫系がCNSをゆっくりと侵食するように誘導し、これは全身の複数の系を含むであろう27。典型的な臨床症状には…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

著者らは、中国国家自然科学財団(32070768、31871404、31900658、32270754)および国家重点薬物研究所からの支援を認めている。

Materials

1 mL syringe(with 26 G needle) Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017031
2 mL microcentrifuge tube HAIKELASI KY-LXG2A
22 G needle Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd 60017208
Complete Freund’s Adjuvant Sigma F5881 Stored at 4 °C, 1 mg of heat-inactivated MTB (H37Ra) per mL
Conditioned place preference system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Ethanol Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218 Stored at RT
Locomotion activity (open field) video analysis system Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd DigBehv-002 Animal behavior
MOG35-55 peptide Gill Biochemical Co., Ltd GLS-Y-M-03590 Stored at -20 °C
Mycobacterium tuberculosis H37Ra BD 231141 Stored at 4 °C
Open field reaction chamber Shanghai Jiliang Software Technology Co., Ltd Animal behavior
Pertussis toxin Calbiochem 516560 Stored at 4 °C
Phosphate Buffered Saline Made in our laboratory
Scissor Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd J21010
Sealing film Heathrow Scientific HS 234526B
Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge Thermo Scientific 75002447
Steel ball QIAGEN 69975
TissueLyser II QIAGEN 85300
Tweezer Shanghai Medical Instrument (group) Co., Ltd JD1060
μCT 35 desktop microCT scanner Scanco Medical AG, Bassersdorf, Switzerland
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Riferimenti

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Wang, C., Lv, J., Zhuang, W., Xie, L., Liu, G., Saimaier, K., Han, S., Shi, C., Hua, Q., Zhang, R., Shi, G., Du, C. Induction and Diverse Assessment Indicators of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (187), e63866, doi:10.3791/63866 (2022).
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